蛇床及其近缘物种的ITS2分子鉴定△

殷秀梅，罗焜，刘美子，罗红梅*

（1.濒危药材繁育国家工程实验室，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.西南大学园艺园林学院，重庆 400716）

蛇床子为我国传统中药， 《中国药典》记载其来源为伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实，具有燥湿祛风，杀虫止痒，温肾壮阳的功能，用于阴痒带下，湿疹瘙痒，湿痹腰痛，肾虚阳痿，宫冷不孕等[1]。现代药理学研究表明蛇床子的药理作用广泛，有抗心律失常、降血压、血脂、镇静催眠、治疗骨质疏松、抗菌、止痒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[2-5]。药用植物蛇床的近缘物种，主要包括同属植物兴安蛇床Cnidiumdauricum（Jacquin）Fischer ＆ C.A.Meyer，同科植物毒芹CicutavirosaLinn.、粗糙独活HeracleumscabridumFranch.和旱芹ApiumgraveolensLinn.。这些近缘物种在外形上与药用植物蛇床极为相似，但药效却完全不同。如毒芹，全草有毒，人畜误食往往发生急性中毒或死亡。

DNA条形码技术是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的新方法。由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出，随后引起学术界的广泛关注[6-7]。ITS2作为DNA条形码序列，因其两端具有保守区便于通用引物设计，序列扩增容易，变异位点充足等优点，而被广泛应用于动植物物种鉴定[8]。本研究选用ITS2序列对蛇床及其近缘物种进行鉴定研究，分析蛇床子基原植物与近缘物种之间的变异性，进化树中物种的聚类情况，以及ITS2序列二级结构的差异，以期建立蛇床及其近缘物种鉴定的新方法，确保临床用药安全。

1 材料与方法

1.1 材料

蛇床新鲜叶片采自中国医学科学院药用植物研究所广西分所药用植物园，标本号PS1219MT01（GenBank登录号JF421487）。蛇床子基原植物及近缘物种毒芹Cicutavirosa、旱芹Apiumgraveolens、粗糙独活Heracleumscabridum、兴安蛇床Cnidium dauricum的ITS2序列下载于GenBank数据库，蛇床及其近缘物种信息见表1。

表1 蛇床及其近缘物种材料信息

1.2 样品DNA提取、PCR扩增和测序

采用植物 DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取DNA。ITS2序列的PCR扩增及测定方法均参考Chen等的研究[8]。

1.3 数据分析

测序获得的峰图利用CodonCode AlignerV3.7.1（CodonCode Co.，USA.）校对拼接以获得可用于后续分析的ITS2序列。实验数据与GenBank下载的ITS2序列均采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和26S区段获得ITS2间隔区序列[9]。通过MEGA5.0软件对不同样本进行序列对比和遗传距离分析，并重构其NJ系统发育树。基于Schultz等[9]的研究预测各物种ITS2二级结构。

2 结果与分析

2.1 蛇床种内ITS2序列变异分析

蛇床的4条参考序列比对后长度为221 bp，GC含量范围为57.5% ～57.9%，平均 GC含量为57.7%。含有1个POLY‘G’结构（大于等于5个单碱基重复），变异位点4处，分别为19位点的AG变异，77，145位点的C-T变异和217位点的A-T变异。蛇床种内平均K2P距离为0.0098，种内最大K2P距离为0.018，种内ITS2序列变异较小。

2.2 蛇床种间ITS2序列变异分析

蛇床与其近缘物种间序列进行比对后长度为230 bp，GC含量范围为52.9%～57.9%，平均GC含量为56.4%。种间ITS2序列变异较大，ITS2序列间存在较多的变异位点（图1）。蛇床种间平均K2P距离为0.2291，种间最小 K2P距离为 0.133，为蛇床（JF421487）和同属植物兴安蛇床（AY330508），见表2。

图1 蛇床与近缘物种的种间ITS2序列比对

表2 蛇床种间K2P遗传距离

2.3 聚类分析

从基于ITS2条形码序列构建的蛇床与其近缘物种的NJ树（图2）可以看出，蛇床不同来源的样品聚为一支，后又与同属植物兴安蛇床Cnidium dauricum聚为一支。其近缘物种毒芹Cicutavirosa、粗糙独活Heracleumscabridum、旱芹Apiumgraveolens均独立为一支。从NJ树图可以看出蛇床能与其近缘物种明显区分开。

图2 基于ITS2序列构建的蛇床与其近缘物种的NJ树

2.4 蛇床及其近缘物种ITS2序列二级结构比较

如图3所示，蛇床与其近缘物种的ITS2二级结构均有螺旋（Helix）Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，蛇床与其近缘物种在螺旋Ⅱ和螺旋Ⅳ上较为保守，在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ上具有差异。结果显示，ITS2二级结构能有效的区分蛇床及其近缘物种。

图3 蛇床与其近缘物种的ITS2二级结构图

3 讨论

近年ITS2作为DNA条形码序列在很多植物鉴定研究中取得良好效果。Chen[8]等对753属4800种藻类、真菌和植物的6600条ITS2序列进行分析，发现其种级水平鉴定效率达到92.7%。ITS2对于不同科属如蔷薇科、豆科、芸香科、黄芪属、重楼属等都有较好的鉴定效果[10-14]。此外，ITS2在大青叶、党参、京大戟等药用植物的鉴定中，均能将基原植物及其近缘物种和混伪品区别开[15-19]。

蛇床及其各近缘物种ITS2序列长度范围为221～229 bp，序列间存在较多的变异位点，无插入／缺失变异。蛇床种内最大K2P距离0.018，种间最小K2P距离0.133，种间最小K2P距离远大于蛇床种内K2P距离。蛇床与其同属植物兴安蛇床的变异位点相对较少，亲缘关系较近，而与同科近缘物种种间变异较大。通过NJ树聚类分析及ITS2二级结构比较，均能将蛇床与其近缘物种明确区分。本研究证实了ITS2序列鉴别蛇床与其近缘物种的可行性，同时为中药材鉴别研究提供了新思路。