葡萄籽和皮萃取物对小鼠乳腺癌细胞迁移的影响

梁志强，陈秋宇，孙向军,*

(1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；

2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240)

葡萄籽和皮萃取物对小鼠乳腺癌细胞迁移的影响

梁志强1，陈秋宇2，孙向军2,*

(1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；

2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240)

目的：研究葡萄籽和皮萃取物对乳腺癌细胞迁移的抑制作用，以及对细胞活力的影响。方法：以小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象，四甲基偶氮唑盐(MTT)实验检测细胞增殖活性；细胞迁移实验检测细胞迁移能力；结果：质量浓度为5μg/mL的葡萄籽和皮萃取物对乳腺癌细胞的迁移具有明显的抑制作用，该抑制作用与药物质量浓度呈现剂量依赖关系；萃取物对癌细胞的活力有明显的抑制作用，葡萄籽和皮萃取物的半数有效质量浓度(IC50)分别为65.427μg/mL和72.408μg/mL。

葡萄籽和皮萃取物；鼠乳腺癌细胞；细胞活力；细胞迁移

近年来，葡萄作为药食兼用植物，其医疗保健作用受到国内外预防医学领域的广泛关注。葡萄中富含葡萄糖、无机盐、维生素以及多种生物活性成分[1]，葡萄籽和皮中的活性成分主要是多酚类化合物，果皮中主要有花色素类、白藜芦醇及黄酮类，籽中主要为原花青素、儿茶素、槲皮苷、单宁等。其中主要的生物活性成分是原花青素，其结构中存在两种最基本的单体：儿茶素和表儿茶素，这两种单体通过聚合可形成寡聚体或多聚体，2～5聚体称为低聚体(olig o me ric procyanidins，OPCs)，5聚体以上则称为高聚体(procyanidolic polymers，PPCs)[2]，即低聚原花青素和高聚原花青素。其中OPCs的生物活性最强。

据国内外相关文献报道，葡萄来源的多酚类化合物的生物活性涉及抗氧化、预防心血管疾病及抑制肿瘤生长等作用。其中，原花青素与大多数黄酮相比，水溶性好，有效性高，生物利用度在90%以上，极易被人体吸收[3]。Merfort等[4]采用化学发光法研究了葡萄籽原花青素对中性粒细胞中的自由基清除作用，结果表明葡萄籽原花青素具有较强的抗超氧阴离子自由基和抗脂质过氧化活性。Vinson等[5]给仓鼠喂食含高脂肪的食物并从中挑选出患动脉粥样硬化的个体，而后用含有原花青素的葡萄籽提取物喂食，结果发现仓鼠的总胆固醇量降低了32%。Ye等[6]用葡萄籽提取物原花青素作用于人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A-427、人胃腺癌细胞CRL-1739，都有明显的抑制作用。而对慢性骨髓性白血病细胞K562无细胞毒作用。Zao等[7]用原花青素作用于12-O-tetraecanoylphorbol-13-acetate (TPA)诱导的鼠皮肤癌症模型，可以使鸟氨酸脱羧酶(ODC)和髓过氧化物酶(MPO)活性降低。研究表明葡萄原花青素能够抑制肿瘤生长，降低肿瘤发生率，减少肿瘤数量以及缩小肿瘤体积，并且在抗辐射、抗衰老以及治疗炎症等方面均有很好的疗效[8]。葡萄残渣中的白藜芦醇也是一种重要的功能性成分，具有显著的体外抗氧化活性，在医药和食品工业领域具有广泛的应用前景[9]。白藜芦醇还是一种天然的抗癌活性物质，对乳腺癌、胃癌、皮肤癌、前列腺癌、胰腺癌等都有抑制作用[10]。此外，葡萄残渣中还含有没食子酸、槲皮苷等酚酸类物质，也具有抗氧化[11]及抗癌作用[12]。可见，葡萄籽和皮提取物中含有的多种具有抗癌作用的多酚类化合物，可能成为未来重要的天然抗癌药物来源。

目前，女性乳腺癌发病率有上升的趋势，发病年龄有提前的迹象。乳腺癌已成为了女性健康的危险因素，受到社会的关注。乳腺癌转移、扩散是导致患者死亡的主要原因，而目前能有效控制乳腺癌转移的治疗方法是很有限的。饮食中的多酚类化合物具有抗肿瘤活性，研究表明葡萄中的多酚化合物能够有效抑制接种在小鼠体内的乳腺癌细胞的生长[13]。葡萄皮、葡萄籽是酿酒工业的废弃物，也是葡萄中多酚类化合物的主要来源。目前对于葡萄籽、葡萄皮中多酚化合物抑制乳腺癌活性的研究主要集中于对肿瘤生长和凋亡的作用，关于其对乳腺癌细胞转移的影响较少涉及。本实验着重研究葡萄籽、皮萃取物对小鼠乳腺癌细胞4T1迁移的抑制作用，为深入探讨葡萄中多酚类化合物抑制乳腺癌转移机理提供实验依据，为有效控制乳腺癌转移提供一个新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠乳腺癌4T1细胞株由上海交通大学提供，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养。

葡萄籽和葡萄皮萃取物粉末(品种为法国霞多丽，原花青素含量≥95.0%，低聚原花青素含量≥60.0%) 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶 吉诺医药生物技术有限公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

CO2培养箱 美国Thermo公司；超净工作台 造鑫企业有限公司；Labsystems Dragon Wellscan MK-3 全自动多功能酶标仪 北京鑫诺恒信科技发展有限公司；倒置显微镜 日本Nikon公司；趋化小室(Boyden Chamber) 美国Costar公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽和皮原液的制备

称取葡萄籽、皮萃取物粉末20mg，溶于2mL无血清的RPMI1640培养基中，0.22μm微膜过滤，再用锡箔纸包裹，备用。

1.3.2 四甲基偶氮唑盐法(MTT)实验

参照Mosmann[14]建立的MTT法，检测萃取物对4T1细胞生长的抑制作用。葡萄籽、皮萃取物设5个终质量浓度为：5、10、20、50、100μg/mL的剂量组，同时设置不加萃取物的对照组。

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，接种于24孔板中，每孔1×105个细胞，体积500μL，每个剂量组重复4孔。5% CO2，37℃过夜贴壁，加入不同质量浓度葡萄籽、皮萃取物。继续培养24h后，去旧培养基，每孔加入500μL新鲜培养基和50μL MTT溶液(50μg/mL)，继续培养4h。小心吸去孔内培养基，每孔加入500μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。再转至96孔板，用自动酶标仪测波长490nm处的OD值。通过生长曲线，查对应的细胞数，计算细胞存活率和细胞抑制率，如式(1)、(2)。通过改良寇式法计算半数有效质量浓度(IC50)，计算最大无毒质量浓度(TC0)。IC50即细胞存活率为50%时的萃取物质量浓度；TC0为细胞存活率大于95%时的药物质量浓度，一般认为其为萃取物作用的安全质量浓度[15]。

1.3.3 细胞迁移实验

细胞迁移实验参照参考文献[16]进行，收集对数期细胞，用RPMI1640培养基悬浮(阳性对照组加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，不加样品)，加载到Boyden Chamber上室，调整细胞浓度为5×105个/mL，每孔样品体积为100μL。实验组萃取物质量浓度为0.1、0.5、1、5、10μg/mL，对照组不加药。下室加入含有与上室相同药物质量浓度的无血清培养基，每孔600μL；每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养2h。取出Transwell小室，把下室换成含相同质量浓度萃取物的新鲜培养基(含10% FBS)，对照组的下室也换新鲜的培养基，继续培养24h。滤膜经4%多聚甲醛固定，伊红-苏木素染液染色，PB S冲洗，制片，最后计数。按式(3)计算迁移率。

2 结果与分析

2.1 细胞接种浓度的筛选

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。本实验以不同浓度的4T1细胞培养24h后，MTT实验检测活细胞数，用酶标仪测其OD值，即得生长曲线。

图1 细胞浓度生长曲线Fig.1 Growth curve of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

由图1可知，在细胞浓度为5×104～5×105个/mL之间，斜率较大，细胞增殖最旺盛，细胞分裂增多，成倍增长，活力最佳。综合考虑故选(1～2)×105个/mL的细胞浓度作为MTT实验的起始细胞浓度。

2.2 葡萄籽和皮提取物对4T1生长抑制作用

表 1 葡萄籽、葡萄皮提取物对4T1细胞的生长抑制作用Table 1 Inhibitory effects of grape seed and skin extracts on mouse mammary carcinoma 4T1 cells

从表 1可见，葡萄籽和葡萄皮萃取物在5μg/mL的条件下，细胞存活率＞95%，即 TC0为5μg/mL，可认为葡萄籽和葡萄皮萃取物在此质量浓度下对4T1细胞的增殖无毒性作用。随着药物质量浓度的增大，其对细胞增殖的毒性作用增大。计算可知，葡萄皮的IC50为72.408μg/mL，葡萄籽的IC50为65.427μg/mL，以上结果表明，经相同质量浓度的葡萄籽萃取物与葡萄皮萃取物处理4T1细胞，其中葡萄籽萃取物处理的细胞存活率较低，抑制率较高，说明葡萄籽萃取物对4T1细胞生长的抑制作用大于葡萄皮萃取物。

2.3 葡萄籽、皮提取物对4T1迁移运动的抑制作用

经不同质量浓度的葡萄籽、皮萃取物分别处理4T1细胞，采用细胞迁移实验研究提取物对4T1迁移运动的抑制作用，结果见图2～5。

图2 葡萄皮萃取物对4T1细胞迁移率的影响Fig.2 Effect of grape skin extract on the migration of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

图3 不同质量浓度的葡萄皮萃取物处理的4T1细胞迁移的图片(×100)Fig.3 Cell migration after treatment with grape skin extract at various concentrations (×100)

图4 葡萄籽萃取物对4T1细胞迁移率的影响Fig.4 Effect of grape seed extract on the migration of mouse mammary carcinoma 4T1 cells

图5 不同浓度的葡萄籽萃取物处理的4T1细胞迁移的图片(×100)Fig.5 Cell migration after treatment with grape seed extract at various concentrations (×100)

由图2～5可见，葡萄籽、皮提取物能够显著抑制4T1细胞的迁移，并且抑制作用呈剂量依赖性。在高倍镜下观察，药物处理组发生迁移的细胞数显著低于对照组，而且与药物质量浓度呈现明显的剂量依赖关系。结果也表明，在相同质量浓度情况下葡萄籽提取物对细胞迁移的阻断作用要强于葡萄皮提取物。

3 结 论

乳腺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康。近些年来，由于对乳腺癌的早期发现，以及综合治疗手段的不断提高，其死亡率呈逐年下降趋势。尽管如此，乳腺癌患者在初次治疗后转移仍然是治疗失败的主要原因[17]。我们知道，恶性肿瘤转移是一个高度受控的、多因子参与的、涉及多个环节的级联反应过程，肿瘤细胞从原发病灶脱落后，侵人周围基质和正常细胞之间，并突破基底膜屏障进入血管或淋巴管向全身扩散，最后在远处器官形成新的转移灶[18]。因为转移肿瘤治疗效果差，仅少数患者对当前的治疗敏感，研究乳腺癌的发病机制，寻找新的抑制其浸润转移的治疗药物，对于降低乳腺癌的死亡率，延长患者的寿命，具有十分重要的意义。

细胞迁移实验是一个检测细胞侵袭和迁移能力的模型。即通过血清诱导，4T1细胞会朝含有血清的滤膜一侧迁移，它可以较真实地模拟体内情况，并能有效地记录细胞迁移特征如细胞形态的改变和迁移细胞数。细胞迁移实验的结果可以反映细胞的迁徙活性，与癌细胞的转移、扩散密切相关。在本实验中，用不同质量浓度的葡萄籽和葡萄皮萃取物处理4T1细胞，考察萃取物对细胞迁移的抑制作用，从而推断其对乳腺癌细胞转移、扩散的抑制作用，结果表明迁移到膜背面的4T1细胞数量的减少与萃取物成剂量依赖性。

MTT实验发现，葡萄皮萃取物的IC50为72.408μg/mL，葡萄籽的IC50为65.427μg/mL，它们的TC0都为5μg/mL。迁移实验结果表明，5μg/mL葡萄籽萃取物对4T1细胞迁移的抑制率＞70%，当萃取物质量浓度达到10μg/mL时，对4T1细胞迁移的抑制率＞90%。5μg/mL葡萄皮萃取物对4T1细胞迁移的抑制率＞60%，当萃取物质量浓度达到10μg/mL时，对4T1细胞迁移的抑制率＞80%。葡萄籽、皮萃取物在安全质量浓度范围内抑制了4T1细胞的迁移，并成剂量依赖关系，这说明葡萄籽、皮萃取物对4T1细胞迁移的抑制作用不是通过直接杀死细胞或抑制细胞繁殖而实现的。对葡萄籽、皮萃取物抑制乳腺癌转移机理的深入研究，将对开发安全、有效治疗乳腺癌新药具有重要价值。

在相同质量浓度的葡萄籽和葡萄皮萃取物条件下，葡萄籽的抑制作用要强于葡萄皮。这主要是由于它们两者的主要成分不同，因此也表现出不同的生物活性。Monagas等[19]的研究中，葡萄籽萃取物中的低聚原花色素和黄烷-3-醇(儿茶素、表儿茶酸)浓度远高于皮，葡萄籽中大约含有2.3～8.2mg/g的黄烷-3-醇和没食子酸，是葡萄皮含量的20倍。而葡萄皮中的高聚原花青素的含量要比籽的多。此外，槲皮素、白藜芦醇、酚酸等多酚类化合物也发挥了重要的作用。Garcia-Mediero等[20]用槲皮素、没食子酸、白藜芦醇等处理鼠的膀胱癌细胞(MB-49)，结果发现它们都具有抑制MB-49的作用，其中25mmol/L白藜芦醇和10mmol/L槲皮素可以诱导MB-49的凋亡，而且槲皮素可以有效的抑制MB-49的迁移，有效率高达40%。这说明葡萄籽萃取物中不仅是原花青素在起作用，还有一些其他的活性物质，抑制效果明显要比葡萄皮萃取物好。

葡萄是全世界种植最广泛、产量最大的水果之一，年均葡萄酒产量在267～300亿L之间，酿酒废弃物大约占葡萄总量的20%[21]，因此对葡萄酒废弃物的再利用引发新的研究热点。根据国家统计局公布的数据，2009年全年葡萄酒产量为96万t，增速27.63%。葡萄酒产量的大幅提高也带来了酿酒废弃物的迅速增加，因此充分利用酿酒残渣生产高附加值产品不仅能够缓解我国的环境污染问题，而且能够提高资源的利用水平，产生更高的经济价值。

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Effects of Grape Seed and Grape Skin Extracts on the Migration of Mouse Mammary Carcinoma Cells

LIANG Zhi-qiang1，CHEN Qiu-yu2，SUN Xiangjun2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China；
2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Objective: To explore the effects of grape seed and grape skin extracts on the migration, viability and proliferation of breast cancer cells. Methods: The viability of mouse mammary carcinoma 4T1 cells was determined by MTT assay and the migration ability by transwell chemotaxis assay. Results: Both grape seed and grape skin extracts significantly reduced the migration of the 4T1 cells in a dose-dependent manner, and exhibited an obvious inhibitory effect on cell migration at a concentration as low as 5μg/mL. The extracts also obviously inhibited the viability and proliferation of the 4T1 cells with IC50(half maximal inhibitory concentration) of 65.427μg/mL and 72.408μg/mL, respectively.

grape seed and grape skin extracts；mouse mammary carcinoma cells；viability；migration

Q279

A

1002-6630(2012)01-0239-05

2011-02-28

上海市科委技术标准专项(07DZ05019)

梁志强(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为食品营养与卫生。E-mail：lzqiang19850405@163.com

*通信作者：孙向军(1967—)，女，副教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：xjsun@sjtu.edu.cn