盐酸川芎嗪注射液细菌内毒素检查法建立的方法学研究

2012-10-25张军华田洪根

药学研究 2012年1期

张军华，田洪根

（滨州市药品检验所，山东滨州256618）

盐酸川芎嗪注射液有抗血小板聚集，扩张小动脉，改善微循环活血化淤作用，并对已聚集的血小板有解聚作用，用于闭塞性脑血管疾病如脑供血不全、脑血栓形成、脑栓塞及其他缺血性血管疾病如冠心病、脉管炎等，临床上常用于静脉滴注，因此控制其细菌内毒素含量对于药品的安全性非常关键.为了更好地控制药品质量，笔者参照《中国药典》2010年版（二部）中“细菌内毒素检查法”，通过研究，我们建立了本品细菌内毒素检查法.

1 仪器与试剂

ZH－2 BLENDER混匀器；TAL－40型恒温器（天津药典仪器厂）；无热原吸头，微量移液器.

细菌内毒素工作标准品（批号：150601－200965，效价180EU／支，中国药品生物制品检定所）；鲎试剂（TAL，灵敏度0.25EU·mL－1，批号1105260，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂（TAL，灵敏度0.25EU·mL－1，批号10041312，福州新北生化工业有限公司）；细菌内毒素检查用水（批号10031005，福州新北生化工业有限公司规格：5mL／支）；盐酸川芎嗪注射液（山东潍坊制药厂有限公司；批号：110402、110602、110603；规格：2mL：40mg）

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度（λ）复核按细菌内毒素检查法［1］，用BET水将细菌内毒素工作标准品稀释成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4个浓度进行实验.结果表明，灵敏度为0.25EU·mL－1的两批鲎试剂符合规定，见表1.结果显示：鲎试剂灵敏度的测定值（λc）在0.5～2λ之间（包括0.5λ和2λ），可用于细菌内毒素检查，并以表示灵敏度0.25EU·mL－1作为鲎试剂的灵敏度.

2.2 盐酸川芎嗪注射液细菌内毒素限值（L）的确定［2］药品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L＝K／M，式中K为按照规定的给药途径，人用每千克体重每1h可接受的内毒素最大剂量，注射剂的K＝5EU／（kg·h）；M为人用每千克体重每1h给药的最大供试品剂量，本品说明书“用法用量”中规定：本品的最大给药量为80mg，按照我国人均体重60kg计算，M＝1.333mg／（kg·h），因此细菌内毒素理论限值为：L＝K／M＝5／1.333＝3.75EU·mg－1.为了更好的保证安全用药，我们设定本品的内毒素限值为3.0EU·mg－1.

表1 鲎试剂灵敏度复核

2.3 供试品的最小有效稀释浓度（MVC）目前市售的鲎试剂灵敏度（λ）通常在0.5～0.03EU·mL－1之间，因此，有效稀释浓度为0.01～0.166 7mg·mL－1之间.

2.4 供试品干扰初筛试验用BET水将盐酸川芎嗪注射液（批号110602）分别稀释成原液、10mg·mL－1、5mg·mL－1、2.5mg·mL－1、1.25mg·mL－1、0.625mg·mL－1、0.312 5mg·mL－1、0.156mg·mL－1、0.078mg·mL－1系列浓度，每一稀释浓度供试品做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液），与鲎试剂混合进行抑制／增强试验，结果表明，供试品在较高浓度时对鲎试剂有干扰作用.在供试品至少稀释至浓度为0.156mg·mL－1后则对鲎试剂无干扰作用，见表2.

表2 干扰试验预实验结果

2.5 供试品干扰试验由干扰初筛试验可知，选择灵敏度0.25EU·mL－1的TAL，用BET水将3批供试品稀释至浓度为0.156mg·mL－1后进行干扰试验.具体操作步骤如下：取36支灵敏度0.25EU·mL－1的TAL，其中18支做内毒素水溶液系列反应，即用0.1mL BET水复溶，再分别加已制备的0.5，0.25，0.125，0.06EU·mL－1内毒素溶液0.1 mL，每一浓度内毒素4支反应管，水溶液阴性对照（NC）2支反应管；另18支做内毒素供试品溶液系列反应，即用0.1 mL BET水复溶，再分别加已制备的含0.5，0.25，0.125，0.06EU·mL－1内毒素的浓度为0.156mg·mL－1的供试品溶液0.1mL，每一浓度内毒素4支反应管，供试品阴性对照（NPC）2支反应管.采用3批供试品，两批不同厂家的鲎试剂，分别进行干扰试验，结果见表3，Et均在0.5～2.0Es范围内，说明供试品稀释至浓度为0.156mg·mL－1后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用内毒素检查法.