采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究

黄丽丽 王文军 李瑞岐 欧阳能勇 杨冬梓

中山大学孙逸仙纪念医院生殖中心，广东广州 510120

卵巢组织冷冻可以为卵巢早衰或癌症需要放化疗的患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷冻是近年来出现的一种新的冷冻方法，该技术将冷冻对象直接投入液氮中快速降温，避免冰晶形成，可以绕开组织内不同细胞成分对慢速冷冻参数要求不同的技术障碍，从而提高冷冻保存效果。玻璃化冷冻的降温速度直接决定冷冻保护剂能否形成玻璃态，而使用的载体是影响降温速度的最重要因素。虽然目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织已有陆续报道，其中采用的载体包括冷冻管[2]、开放式麦管[3]、最小微滴法[4]以及不锈钢网筛[5]等，然而究竟何种载体更适合人卵巢组织玻璃化冷冻，需进一步研究。固相表面玻璃化技术（solid-surface vitrification，SSV）是近年新出现的一种简便有效的玻璃化方法，笔者前期曾成功将其用于玻璃化冷冻人卵巢组织片，并取得了与慢速程序化冷冻相当的效果[6]。本研究的目的是比较固相表面玻璃化冷冻和其他载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果。

1 材料与方法

1.1 人卵巢组织标本的收集与预处理

卵巢标本取自2011年11月～2012年6月就诊于中山大学孙逸仙纪念医院妇产科、需经腹或行腹腔镜手术的16例患者，年龄 21～40 岁，平均（32.7±5.9）岁；有规律的月经史，无内分泌紊乱，无放化疗史，半年内无激素服用史，且卵巢囊肿直径＜7 cm。其中，良性卵巢囊肿8例，子宫肌瘤5例，宫颈癌3例。所有患者均签署知情同意书，本研究得到了中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准。

新鲜卵巢组织浸泡于含10%人血白蛋白+青链双抗的L-15培养液（Gibco公司）中，于体式显微镜下去除多余髓质后，切成约5 mm×1 mm×1 mm大小的皮质小条，随机分配到不同的实验组：新鲜组（F组）、冷冻管玻璃化组（TV组）、最小微滴玻璃化组（MDS组）、不锈钢网筛玻璃化组（SLV组）和固相表面玻璃化组（SSV组）。新鲜组直接以4%多聚甲醛液固定。

1.2 玻璃化冷冻和复苏过程

采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）的L-15溶液为玻璃化冷冻液。将卵巢组织依次浸泡于4℃25%、50%、75%和100%浓度的玻璃化冷冻液中逐步导入冷冻保护剂后，采用不同载体行玻璃化冷冻：①TV组将卵巢置于含有1 mL 4℃100%玻璃化冷冻液的无菌冷冻管中投入液氮；②MDS组用无菌的巴氏管将卵巢组织直接滴入液氮中；③SLV组将卵巢组织置不锈钢网筛上投入液氮中；④SSV组将卵巢组织置于已在液氮中预冷的铝箔上投入液氮中，在液氮面之下将卵巢组织收集入冷冻管中液氮保存。

复苏时将冷冻管从液氮中取出，静置10 s，除TV组将冷冻管置于37℃水浴中2～3 min取出卵巢组织外，MDS组、SLV组和SSV组打开冷冻管取出卵巢组织，将其依次转移到0.5、0.25和0.125 mol/L蔗糖溶液中，洗涤后于37℃培养箱中静置备用。

1.3 人卵巢皮质片的体外培养

卵巢组织体外培养体系参考文献[7]。将复苏的卵巢组织置于嵌入式培养皿Millicell-ORG（Millipore公司）上培养。培养液成分：α-MEM液，2.5%人白蛋白，1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠ITS（含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠），500 mIU/mL重组人促卵泡生成素（rhFSH）以及青链双抗。培养10 d，每2天更换新鲜培养液，吸出的培养液用于激素测定。培养结束后所有的卵巢组织用于组织学检测。

1.4 组织学分析

卵巢组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后4 μm连续切片，行HE染色，每10个切片在光镜下观察计数一次。原始卵泡和初级卵泡计数以卵母细胞核作为标记，盲法计数每个标本中形态正常的原始卵泡和初级卵泡。参照Gougeon标准[8]进行卵泡分级和卵泡形态评价。

1.5 雌孕激素的测定

将更换的培养液收集于无菌EP管中，置于-20℃冰箱保存，培养结束后统一采用美国全自动化学发光免疫分析系统ACS：180SE测定雌孕激素水平。

1.6 统计学方法

使用SPSS 11.0统计分析软件，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析和χ2检验进行统计学分析组织学结果，对培养液中雌二醇和孕酮的测定采用GLM中重复测量的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢皮质组织学分析结果

冷冻前后的组织切片在光镜下均可见到形态正常和闭锁的卵泡（图1）。冻融后各组卵巢组织中卵泡形态正常率低于F组（P＜0.05）。其中，SSV组原始和初级卵泡正常形态率最高（P＜0.05），其次为MDS组和SLV组，后两组之间差异无统计学意义（P＞0.05），TV组卵泡正常形态率最低（P＜0.05）（表1）。

图1 冻融前后卵巢组织中不同级别的卵泡HE染色（×400）

表1 新鲜组和四组冻融后卵巢组织中原始和初级卵泡的平均正常形态率（±s，%）

表1 新鲜组和四组冻融后卵巢组织中原始和初级卵泡的平均正常形态率（±s，%）

注：F组为新鲜组；TV组为冷冻管组；MDS组为最小微滴组；SLV组为不锈钢网筛组；SSV组为固相表面玻璃化组；与F组比较，*P＜0.05；与TV组比较，#P＜0.05；与 SSV组比较，▲P＜0.05

组别 原始卵泡 初级卵泡F组TV组MDS组SLV组SSV组90.27±6.02 64.57±11.84*78.36±7.62*#▲77.21±6.51*#▲84.70±5.03*83.56±7.99 59.95±15.27*72.34±9.72*#▲71.60±9.53*#▲79.75±6.54*

2.2 卵巢组织的体外培养

经过体外10 d培养后，各组卵巢皮质的边缘变圆滑。光镜下各组卵巢皮质培养后均可见到存活卵泡，见图2。如图2所示，与新鲜未培养卵巢组织相比，培养后的各组卵巢组织中原始卵泡所占的比例均下降（P＜0.05），生长卵泡（包括初级和次级卵泡）比例均上升（P＜0.05）。新鲜未培养组原始卵泡和生长卵泡的比例分别为85.96%和14.04%；TV组培养后为60.66%和33.34%；MDS组培养后为 56.24%和43.76%；SLV组培养后分别为54.79%和45.21%；SSV组培养后为46.0%和54.0%。SSV组冻融组织体外培养后初级卵泡比例明显高于其他冷冻组（P＜0.05），同时原始卵泡所占比例明显低于其他冷冻组（P＜0.05）。TV组培养后两类卵泡比例与其他各组之间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），培养后MDS组和SLV组的两级卵泡所占比例组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 新鲜组和培养后各玻璃化组卵巢组织中原始卵泡和初级卵泡所占比例

2.3 培养液中激素的测定结果

体外培养的10 d中，与新鲜培养液相比，复苏后卵巢组织培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随着培养时间逐渐升高（图3A、3B）。SSV组雌二醇和孕酮平均浓度明显高于其他组（P＜0.05）。TV组的两种激素水平均显著低于其他各组（P＜0.05）。MDS组与SLV组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各玻璃化组卵巢组织体外培养液中雌二醇（A）和孕酮（B）的浓度

3 讨论

玻璃化冷冻过程需要一个特殊的载体承载冷冻保护液和组织细胞，对于卵巢组织而言，载体需要一定的容积同时要尽量减少所需冷冻液的体积以提高降温速度。此外，当组织被浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹在组织周围，由于其低导热性形成有效的绝热区从而减缓了降温速度[9]。由此可见，载体的选择要考虑上述多种影响因素。目前已有多种载体被实验性地应用于玻璃化冷冻过程，如冷冻管（cryovial）、开放式拉长麦管[10]、最小微滴法和不锈钢网筛等。

冷冻管被应用于卵巢组织的程序化冷冻，但因管壁较厚和所需较多冷冻液，导致降温速度慢，不能满足玻璃化形成的需要。在本研究中，冷冻管玻璃化组的正常形态原始卵泡仅为64.57%，冻存效果显著低于其他组。Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷冻猴子的卵巢组织，复温后约70.4%的卵泡保存正常形态。本研究中也使用了该方法玻璃化冷冻人卵巢组织，复温后形态学检测可见约78.36%的原始卵泡保存了正常形态，低于新鲜组和SSV组；体外培养后，生长卵泡比例增加，但仍低于新鲜组和SSV组，提示直接微滴玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态及发育潜能存在一定影响。

固相表面玻璃化法是近年新出现的一种有效、简便的玻璃化技术，曾成功用于玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞[11]和羊卵巢组织[12]。与前述各载体相比，SSV法具有其独特的优势：首先，由于该方案是直接将组织置于已经在液氮中半悬预冷至-150～-180℃的固相表面，因而可以避免液氮蒸发产生气泡导致的热传导阻滞[13]；其次，SSV技术与液氮接触的相对面积更大，而且可以将冷冻组织所需的冷冻保护剂减至最少，从而提高降温速度，促进玻璃化的形成[12]。第三，应用此方法可以冷冻较大体积的卵巢组织，能在较短时间内完成大量卵巢皮质的冷冻保存。第四，在SSV方法中，因直接将载有组织的玻璃态微滴浸入37℃复温溶液中，可以很快复温，避免冰晶再形成的发生从而减少对组织细胞的损伤。目前在SSV方法中使用的预冷的固相表面材料多报道为铝箔，主要原因是铝箔兼具优良的导热性和延展性，且价格便宜，便于操作。

笔者曾率先将SSV技术用于保存人卵巢组织，并证实其冷冻效果与传统的程序化冷冻效果相当。在本研究中，进一步将SSV与其他载体（冷冻管、最小微滴法和不锈钢网筛）相比，探讨对解冻后卵巢组织中卵泡形态和体外生长能力及激素分泌功能的影响。结果显示，解冻后，SSV组约有84.70%的原始卵泡维持了正常的形态，虽稍低于新鲜卵巢组织正常形态率（约90.27%），但与其他文献报道的冷冻后70%～90%的原始卵泡正常形态率大致相当[14-15]。冻融的卵巢组织培养后原始卵泡比例比新鲜未培养组降低，生长卵泡比例增加。SSV组生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组，培养液中雌二醇和孕酮平均浓度亦高于其他玻璃化组。由此证实SSV技术比冷冻管、最小微滴法和不锈钢网筛作载体有优越之处，更适合人卵巢组织的有效玻璃化冻存。

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