VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

丁治国 何 蓓 陈晓珩 汪唐顺 高 翔 李乃卿

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特异性血管内皮细胞有丝分裂素，与受体结合后促进内皮细胞分裂、增殖、迁移，加速形成新生血管。研究表明，VEGF及其受体在肝癌癌组织中较正常肝组织呈过表达，并与肝癌的生长、转移、复发及治疗密切相关[1-3]。因此，VEGF已成为目前肿瘤抗血管治疗的热点。笔者前期研究发现课题组原研药物参芪扶正注射液可显著抑制人肝癌细胞MHCC97L的生长、侵袭能力，并能下调VEGF基因表达。为进一步明确VEGF基因“沉默”时药物作用的变化，本研究构建了能转录产生VEGF shRNA的质粒，进而构建并包装产生高滴度的慢病毒RNAi载体，并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达，抑制MHCC97L细胞中VEGF基因的表达，为进一步深入研究VEGF基因与参芪扶正注射液药物效果的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Platimum HIFI Taq Polymerase高保真扩增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特异性引物、10×PCR Buffer、Mg2+（50 mmol/L）、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L

dNTPs（购自美国Invitrogen公司）；T载体、plenti6.3MIR载体、293细胞、DH5α感受态细胞、ddwater（购自上海诺百生物科技有限公司）；T4 Ligase（购自加拿大NEB公司）；DMEM培养基（购自美国HYCLONE公司）；FBS（购自法国biowest公司）；24孔和6孔细胞培养板（购自美国Corning公司）；荧光显微镜（购自日本Olympus公司），荧光定量PCR仪（购自美国Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 载体的构建和鉴定 针对人类VEGF基因mRNA序列（NCBI GenBank，基因编号：AF022375），利用 invitrogen 公司BLOCK IT RNAi DESIGNER工具设计干扰序列如下，200-F：TGCTGTGAAGATGTACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA；200-R：TGCTGTGAAGATG TACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA； Negative-F：TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT；Negative-R：CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC。将 2对 oligo（包括阴性对照链）退火成双链。然后连接线性化的plenti6.3-MIR载体，构建2个miRNA慢病毒载体质粒，并转化至感受态细胞DH5α。挑选阳性克隆，用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。

1.2.2 RNAi慢病毒的包装 取对数生长期细胞293T细胞，按照每个10 cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中。转染前2 h将细胞培养基更换为Opti-MEM培养液；取9 μg Packaging Mix和 3 μg慢病毒表达质粒加入 1.5 mL Opti-MEM（经 37℃预热）中混匀；取 36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中混匀；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20 min；将3 mL质粒脂质体复合物加入到细胞培养皿中混匀，置37℃，5%CO2的培养箱中孵育6 h后，更换完全培养液DMEM+10%FBS；48 h后收集细胞培养上清，3 000 r/min离心10 min，去除细胞和碎片，并用0.45 μm的滤器过滤；将病毒原液在50 000 g下超速离心2 h，去除上清，重悬于200 μL DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃下备用。

1.2.3 孔稀释法测定病毒滴度 测定前1 d，对293T细胞进行传代，96孔板上每孔加入约8 000个细胞，体积100 μL。将病毒储存液按梯度稀释（每50微升中含慢病毒液1×10-3～1×10-8mL），吸去96孔板中原先的培养基，然后在每孔中加入50 μL慢病毒稀释用培养基，混匀各管慢病毒稀释液，再各取50 μL慢病毒稀释液加入到每孔细胞中，每个稀释度3个重复。继续放入CO2培养箱中培养。48 h后，每孔加入100 μL新鲜培养液。5～6 d后观察荧光表达，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数，病毒滴度（TU/mL）=（荧光细胞个数×转染时细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积）×1/稀释浓度。

1.2.4 荧光定量PCR检测VEGF表达 以MOI值100浸染人肝癌MHCC97L细胞48 h后收集细胞。按Trizol裂解液说明书进行细胞RNA的抽提；按照逆转录试剂盒说明进行逆转录：取 1 μg RNA，用 oligodt18 引物，42℃ 60 min，70℃ 5 min进行逆转录。VEGF上游引物 5’-ACTGCCATCCAATCGA GACCC-3’，下游引物 5’-TGAGGTTTGATCCGCATAATC-3’。内对照β-Actin上游引物5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。按实时PCR试剂盒说明配制反应体系，反应置于荧光定量PCR仪中，设定程序：预变性 95℃ 120 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，40个循环；荧光信号实时检测。以MHCC97-空白组细胞为对照，采用 2－△△CT（CT 代表循环阈值）法计算相对定量。

2 结果

2.1 oligo连接入plenti6.3-MIR测序DNA

测序结果证实oligo已正确连接入plenti6.3-MIR，序列与预期序列完全一致（图1）。

图1 oligo连接plenti6.3-MIR测序（部分）

2.2 RNAi慢病毒的包装

plenti6.3-MIG-200转染实验24 h后，在荧光显微镜下（×100）同一视野的荧光和可见光照片对比，可见大部分细胞发出荧光（图2），说明转染成功。

图2 在荧光显微镜下观察RNAi慢病毒的包装（×100）

2.3 RNAi慢病毒滴度测定

根据荧光显微镜和普通显微镜（×100）下同时观察plenti6.3-MIG-200病毒感染293T细胞，在荧光显微镜下，在加入10-8mL病毒原液的孔中观察到表达绿色荧光的细胞分别为37、25和 35 个， 则病毒的滴度为：[（37+25+35）TU/3]/1×10-8mL=3.23×109TU/mL。

2.4 荧光定量PCR检测VEGF表达

RNAi慢病毒对人肝癌MHCC97L细胞的浸染率大于90%（图3），荧光定量PCR数据结果显示：MHCC97-200组RNAi慢病毒对VEGF基因的干扰效率达到72.2%（表1）。

图3 在荧光显微镜下观察plenti6.3-mir-200浸染48 h后效果

表1 荧光定量PCR检测RNAi慢病毒对VEGF基因的干扰效率

3 讨论

RNAi是一种转录后基因沉默现象，具有序列特异性的特点，shRNA可被切割为小干扰性RNA（small interfering RNAs，siRNA），大小一般为21～23个核苷酸，以siRNA作为引导序列，与其具有完全互补序列的同源mRNA，具有特异性抑制目的基因表达的功能，并且新产生的siRNA可形成沉默复合物，继续对mRNA降解，从而产生级联放大效应[4-5]。由于RNAi技术抑制目的基因表达的效果确切，并且具有穿透性高和级联式放大效应等特点，因而在基因功能研究中具有很好的应用前景[6]。

慢病毒载体是一种新的病毒载体系统，是在HIV-Ⅰ病毒的改造基础上形成的，其能够高效率地向动物或人的细胞系中导入目的基因，慢病毒载体具有明显的优点，其介导的目的基因可完全整合到宿主细胞的基因组中，发挥基因表达或沉默作用持续并且稳定，并且不随着细胞的传代而减弱，从而实现目的基因的长期表达[7]，这一点与目前常见的腺病毒载体、腺相关病毒载体和传统逆转录病毒载体相比具有显著优势。当慢病毒载体用于RNAi研究时，不但可以高效抑制目的基因的表达，同时还可以充分发挥其作为病毒载体的自身优势，是基因功能研究中的有力工具[8-10]。

笔者前期研究发现课题组的原研药物——参芪扶正注射液，可显著抑制人肝癌细胞MHCC97L的生长、侵袭能力，并能下调VEGF基因表达，为进一步明确VEGF基因是否是药物发挥抑瘤作用的关键，需要在体内外实验中实现VEGF基因在人肝癌细胞MHCC97L中“沉默”，以便在VEGF基因沉默状态下进一步研究药物抑瘤作用的变化。本研究成功构建了能转录产生VEGF shRNA的质粒，进而构建并包装产生高滴度的慢病毒RNAi载体，并有效整合至人肝癌MHCC97L细胞中，显著抑制了MHCC97L细胞中VEGF基因的表达，抑制率达72.2%，这将为今后从体内、体外系统研究VEGF沉默对参芪扶正注射液抑瘤作用变化的影响提供可靠的技术平台。

[1]Suzuki H，Seto K，Shinoda Y，et al.Paracrine upregulation of VEGF receptor mRNA in endothelial cells by hypoxia-exposed HepG2 cells[J].Am J Physiol，1999，276（1 Pt 1）：92-97.

[2]Zhou S，Tan C，Dai Z，et al.Tacrolimus Enhances the invasion potential of hepatocellular carcinoma cells and promotes lymphatic metastasis in a rat model of hepatocellular carcinoma：involvement of vascular endothelial growth factor-C [J].Transplantation Proceedings，2011，43（7）：2747-2754.

[3]Inoue K，Torimura T，Nakamura T，et al.Vandetanib，an inhibitor of VEGF receptor-2 and EGF receptor，suppresses tumor development and improves prognosis of liver cancer in mice[J].Clin Cancer Res，2012，18（14）：3924-3933.

[4]Hammond SM，Bernstein E，Beach D，et al.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature，2000，404（6775）：293-296.

[5]Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science，2002，296（5567）：550-553.

[6]Pushparaj PN，Aarthi JJ，Manikandan J，et al.siRNA，miRNA，and shRNA：in vivo applications[J].J Dent Res，2008，87（11）：992-1003.

[7]Heilbronn R，Weger S.Viral vectors for gene transfer：current status of gene therapeutics[J].Handb Exp Pharmacol，2010，（197）：143-170.

[8]Leite LH，Sharma NM，Bafna S，et al.Construction and validation of lentiviral vector carrying rat neuronal nitric oxide synthase in vitro and in vivo[J].J Neurosci Methods，2012，211（1）：77-83.

[9]Liu X，Tang Z，Zhang Y，et al.Lentivirally overexpressed T-bet regulates T-helper cell lineage commitment in chronic hepatitis B patients[J].Mol Med Report，2012，6（2）：361-366.

[10]Chang SH，Chung YS，Hwang SK.Lentiviral vector-mediated shRNA against AIMP2-DX2 suppresses lung cancer cell growth through blocking glucose uptake[J].Mol Cells，2012，33（6）：553-562.