大孔树脂纯化野葛总黄酮的工艺研究

陈雅维 王丹丹

河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳 471003

野葛为豆科植物野葛 Pueraria lobata（Willd．）Ohwi的干燥根。野葛中富含多种黄酮类物质，主要为大豆素、大豆苷、葛根素等，具有抗氧化、抑菌、解酒保肝、抗癌等作用，并且在防治心脑血管疾病、高血压、糖尿病诸方面都取得显著成果[1-3]。大孔树脂是一类有较好吸附性的有机高聚物吸附剂，常用于天然产物中黄酮类物质的分离纯化[4-5]。本试验就大孔树脂对野葛总黄酮的吸附和解吸工艺进行了研究及优化，对于充分开发利用我国丰富的野葛资源具有重要意义。

1 仪器与试药

1.1 试药

野葛购于张仲景大药房，用粉碎机粉碎后过40目筛备用。葛根素标准品（购于中国药品生物制品检定所，批号：110752-200912）。HPD-750、HPD-600、AB-8、ZKA-Ⅱ、ADS-17等型号大孔树脂由河北沧州宝恩化工有限公司提供。95%乙醇、盐酸、氢氧化钠等试剂均购自天津市化学试剂三厂，且均为分析纯。

1.2 仪器

JA3003型电子天平（上海天平仪器厂），3200B型超声波清洗器（50 HZ，220 V，150 W，昆山市超声仪器有限公司），UV-2000型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 试验方法

2.1.1 样品总黄酮含量的测定 以葛根素为标准品，在250 nm波长处测定吸光度，以质量浓度为纵坐标（C），以吸光度为横坐标（A），得线性回归方程为：C=-0.000 4+0.011 4A，r=0.998 4。

2.1.2 野葛粗提液的制备 将处理过的野葛粉，按固液比1∶8加入95%乙醇浸润1 h。回流提取，抽滤并浓缩成上样液。取样测定总黄酮质量浓度。

2.1.3 大孔树脂预处理 新树脂先用乙醇覆盖，浸泡至充分溶胀，然后用乙醇洗涤至洗涤液无浑浊。再用蒸馏水洗净乙醇，转入酸碱处理。加入3%～5%盐酸溶液浸泡2 h后，用同样浓度5～7倍体积量盐酸溶液淋洗，再用纯水充分淋洗，直至出口洗涤液pH值呈中性，然后以5%氢氧化钠溶液按以上方法浸泡2 h，并用同样方法淋洗至通完5～7倍体积量氢氧化钠溶液，再用水充分淋洗直至出水pH值呈中性，即可再次投入使用[6-7]。

2.1.4 树脂筛选试验 准确称取处理好的HPD-750、HPD-600、AB-8、NKA-Ⅱ、ADS-17型号树脂各1.00 g置于烧杯中，分别加入20 mL野葛粗提液（总黄酮质量浓度44.80 mg/mL）。每5 min振动1次，持续2 h，静置24 h，使树脂达到饱和吸附，抽滤得澄清溶液，测定吸光度并计算各种树脂对野葛总黄酮的吸附量。将5种饱和吸附树脂置入烧杯中，分别加入20 mL 70%乙醇进行超声解吸，每10 min超声2 min，持续2 h，静置24 h，使树脂充分解吸。抽滤得解吸液，测定吸光度并计算各种树脂对野葛总黄酮的解吸率[8-10]。

式中：Q为吸附量，单位mg/g；C0为初始浓度，单位mg/mL；Cr为剩余浓度，单位mg/mL；V为溶液体积，单位mL；W为树脂质量，单位g；A为吸附率，单位%；R为解吸率，单位%；Cd为解吸液浓度，单位mg/mL；Vd为解析液体积，单位mL。

2.1.5 动态吸附试验 取静态吸附试验筛选出的理想树脂20 g，湿法装柱（2 cm×30 cm），对于吸附泄露曲线、上样液的浓度及pH值等因素进行动态吸附试验，以获得该树脂的动态试验最佳工艺条件[11-12]。

2.2 结果分析

2.2.1 大孔树脂的静态吸附与解吸能力比较 分别测定了5种树脂的饱和吸附量及解吸率，通过比较优选出综合性能较好的1种树脂，用于后续的动态试验研究。不同种类树脂的静态吸附和解吸结果，见表1。

表1 5种树脂静态吸附及解吸效果结果

从表1中可以看出，AB-8、NAK-Ⅱ以及ADS-17型大孔树脂的饱和吸附率较大，均大于130 mg/g，其中AB-8及NAK-Ⅱ型树脂的解析率均大于75%。此外，由于AB-8型树脂廉价易得，综合考虑选择AB-8型大孔树脂进行后续动态试验。

2.2.2 上样液浓度的影响 取提取液（总黄酮浓度29.46 mg/mL）10 mL，分别稀释 0、2、3、5、7 倍，以 2BV/h 的流速进行动态吸附，之后用5BV水以2BV/h的流速洗脱，再以70%乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。见图1。

从图1中可看出，上样液浓度对于野葛总黄酮的吸附影响较大。若上样液浓度低，传质未进行彻底就可能泄漏，且吸附处理时间延长，效率降低，不利于实际工业生产；若上样液浓度太大，则黏度大，传质速度变慢，黄酮未吸附就已泄露，吸附率依然低下。因此，当上样液浓度约为9.82 mg/mL时，树脂吸附率最大，可达91%以上。

2.2.3 动态吸附泄露曲线 取野葛粗提液（总黄酮浓度9.82mg/mL）加于柱顶，以2BV/h的流速进行动态吸附，收集流出液，于250 nm处测定吸光度，绘制泄露曲线。见图2。

从图2可看出，树脂在吸附1BV时就有轻微泄漏，上样量超过2BV后，洗脱液浓度变化不大，在4BV时基本达到饱和，可知树脂的动态平衡吸附浓度为9.41 mg/mL，从经济角度考虑，上样量选择2BV。

2.2.4 动态解吸曲线 将上述经动态吸附的树脂，先用5BV水以2BV/h的流速洗脱，再以70%乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定吸光度，绘制该树脂的解吸曲线。见图3。

由图3可知，采用70%乙醇洗脱基本没有拖尾，洗脱液用量为4BV时，基本可将吸附的总黄酮洗净。

2.2.5乙醇体积分数的影响 取一定量提取液（总黄酮浓度为9.82 mg/mL），以2BV/h的流速进行动态吸附，之后用5BV水以2BV/h的流速洗脱，再分别用体积分数为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。见图4。

从图4中可看出，对于AB-8这种弱极性树脂来说，当乙醇体积分数过小，极性较大，柱上吸附的总黄酮不易解吸。因此，当乙醇体积分数为70%，洗脱效果较好，解析率可达92%以上。

2.2.6洗脱pH的影响 取一定量提取液（总黄酮浓度9.82 mg/mL），用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调节pH值为1～2、3～4、5～6、7～8、9～10，之后用 5BV 水以 2BV/h 的流速洗脱，再以70%乙醇2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。见图5。

由图5可知，当pH在5～6范围内，动态洗脱效果较好，解析率可达93%以上。

3 讨论

通过考察5种不同型号的大孔树脂对于野葛总黄酮提取液的吸附率及解析率，优选出AB-8型树脂。选用AB-8型树脂装柱，进一步通过动态试验获得AB-8型树脂最优工艺条件为：上样液浓度9.82 mg/mL，上样液体积2 BV，洗脱剂乙醇体积分数70%，洗脱pH 5～6，可达较好的吸附及解吸效果。其吸附率吸附率可达91.21%，解吸率可达93.61%。试验中发现再生树脂的吸附率有明显下降，需要进一步试验可行的树脂再生方法，以提高其工业化应用价值。

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