VEGF-siRNA在肾癌中的实验研究

隋玉东 王晓民 杨德君 王科亮

哈尔滨医科大学附属四院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150001

肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤，在治疗上通常采用的是手术治疗，但是在早期诊断时有大约30%的患者存在转移的现象，其转移的主要方式是血道转移和淋巴道转移[1]。肿瘤的转移是涉及很多因子的复杂过程，研究发现有很多因子参与转移过程，最值得关注的是血管内皮生长因子VEGF，其是通过旁分泌的方式释放，从而刺激肿瘤血管的生成，加快肿瘤的生长，VEGF不仅加快血管生长速度，也增加血管的通透性，Ferrara等[2]报道中提及肾癌的肿瘤的生长是通过自分泌和有通透性的作用。为了减少肾癌的远处转移和抑制肿瘤的生长速度，采用了对siRNA和血管内皮生长因子的研究，探讨肾癌的治疗前景。

1 材料与方法

1.1 实验体外过程

1.1.1 实验材料 肾癌细胞786-0由实验室自身提供，siRNA的设计：在Gene Bank查找编码人VEGF cDNA的序列，应用Ambion公司RNAi设计软件并参考有关文献，进行全基因组扫描和序列同源分析，设计针对VEGF mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，上述由广东锐博合成所需的编码RNA，然后由该公司转导质粒中。

1.1.2 方法 siRNA的合成：广东锐博根据提供参考的碱基对5′-GATCCACCTCACCAAGGCCAGCACTTCAAGAGAGTGCTG GCCTTGGTGAGGTTTTTTTTGGAAGTCGACA-3′（有义链）；3′-GTGGAGTGGTTCCGGTCGTGAAGTTCTCTCACGACCGGAA CCACTCCAAAAAAACCTTCAGCTGTTCGA-5′，合成目的 siRNA。

1.1.3 质粒的转导和提取 由广东锐博根据碱基序列合成所需的质粒，并由广东锐博将质粒转导大肠杆菌中，再放进摇箱进行摇晃，观察甘油菌的生长情况，同时加氨苄西林将非耐药的大肠杆菌杀死，使其含目的质粒的基因在大肠杆菌内大量繁殖。然后将质粒提取检测质粒，加入甘油进行保存。

1.1.4培养细胞 将实验室提供的肾癌786-0细胞系放置于人工培养液血清1640中，每24小时更换培养液，置于37℃温箱中进行繁殖、传代，冻存以备后期使用。

1.1.5 细胞分组和转染细胞 将培养的肾癌细胞进行分组，分为空白组、目的组、含空质粒组、其他干扰因子组四组，转染前24 h，进行细胞准备，实验前24 h接种细胞，每孔细胞0.8×105个，密度为50%，第2天细胞密度增加至75%左右时，进行细胞转染。

1.1.6 检验转染是否成功 将转染后的细胞进行传代繁殖，挑选状态好的细胞进行荧光下显像，观察细胞的形态以及分析是否转染成功，也可以通过RT-PCR技术检测是否转染成功。在图1中可以看出转染后的肾癌细胞呈现梭形，在荧光显微镜下能够看出荧光梭行肾癌细胞，结构完好，荧光显色均匀，未见肾癌细胞的破裂，转染成功。

1.1.7 WESTER-BLOT 此步骤是为了检验蛋白产生，具体步骤如下：①先将细胞在超声下均浆破碎；②加入1.5 mL的裂解液，震荡混匀，冰上孵育30 min，离心，将上清液弃去，加入Nonidet P40至浓度0.6%，摇匀，冰上孵育10 min，将沉淀悬浮于0.5 mL的loadingbuffer中，样品在冰上孵育30min，2000 r/min，4℃下离心10 min，将沉淀的蛋白分装，保存。将等量蛋白样品经10%SDS-J聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以湿转法移到NC膜上，转移缓冲液转移条件为电流1 A，将时间调制1 h，转移后的NC膜经3%BSA室温封闭3 h，加入适当稀释的一抗，在4℃下过夜，用洗涤液buffer洗膜3遍，加入相应的二抗，在37℃下反应2 h，洗膜，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。在图2中能够清楚看见，在蛋白电泳中出现蛋白条带阳性，间接表示转染后的肾癌细胞中有转染后VEGF蛋白表达。

1.1.8 细胞生长曲线 将肾癌细胞786-0制成细胞悬液接种于96孔板上，每孔浓度1×107/L，24 h后更换培养液，同时加入不同浓度的siRNA，每隔24 h取3孔做细胞计数，取平均值。

1.1.9 CCK-8法 很多实验应用MTT方法，但是CCK-8在实验中具有简便、安全、精确的优点。步骤：接种细胞悬液于96孔板内，经37℃、5%CO2培养箱培养至细胞贴壁，再分别加入不同浓度的Ki67 siRNA,，每一浓度做3个复孔，并以negative siRNA和空白做对照，37℃下5%CO2培养箱培养72 h，有另外几孔已知数量的活细胞以备制标准曲线。将CCK-8试剂解冻，每孔加入10 μL，注意不能有气泡，放置培养箱4 h。用酶标仪检测在450 nm波长的吸光度，参照对照比630 nm波长。根据公式抑制率=（1-实验组A值/阴性对照A值）×100%计算抑制率。

1.2 体内实验部分

1.2.1 小鼠分组 动物实验模型的建立与分组：给予正常的18只小鼠正常喂养，然后将小鼠标有数字，写在卡片上，放在暗箱中随机分组，将其分为3组，分别是目的组（VEGF），绿色荧光组（GPF），空质粒组（Control），每组 6 只小鼠，将小鼠进行同样饮食饲养，饲养天数为21 d。然后将体外培养好的带有目的基因的肾癌细胞，配制密度1.0×107个/mL，在每只小鼠的背部皮下注射细胞悬液约0.3 mL，然后正常喂养小鼠，其他两组依次按此法喂养。

1.2.2 计算测量肿瘤大小 观察瘤体体积：在正常饲养小鼠的情况下，每隔1 d用卡尺测量最大直径的长度A和与之垂直的最大宽径B，利用公式得出相应结果，比较各组小鼠的生长情况，绘制肿瘤的生长曲线。

1.2.3 测量血管密度 病理形态观察和免疫组化检测VEGF表达、血管密度。在实验结束后处死小鼠，取出肿瘤组织，应用常规HE染色，观察组织变化，用兔抗鼠VEGF作为一抗，按照说明进行SABC法免疫组织化学染色，随机在肿瘤的边缘与正常组织取平均值MVD，计算与同视野下的肿瘤细胞总数均值的比值，作为肿瘤细胞VEGF的表达阳性率MVD技术按Weidner评价标准进行。

1.3 统计学方法

利用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多个样本之间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞表达VEGF的阳性率

在目的组（VEGF）、绿色荧光组（GPF）、空质粒组（Control)的肾癌细胞中，应用免疫荧光法检测VEGF在肾癌细胞中的表达，在绿色荧光组（GPF）中和空质粒组阳性率很高，在目的组中很低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 肿瘤生长曲线

含有VEGF的小鼠的背部的肿瘤体积随着时间的增长，三组小鼠的背部肿瘤的大小不一，在同一时间点上相比含有VEGF的小鼠肿瘤体积最小，VEGF组与GPF组、对照组相比，肾肿瘤的体积远远小于对照组和GFP组，对照组和GPF组相比，其肿瘤体积差异不大。见图3。

2.3 组织中血管密度

在三组小鼠中，通过SABC法免疫组织化学染色显示，在VEGF组中血管密度比其他两组在同期中都低，在对照组中血管密度最高，GPF组介于VEGF组和对照组之间，在同组中每只小鼠的血管密度变化不大，说明siRNA-VEGF在肾癌中具有抑制肿瘤生长的效果。见表1。

表1 组织中血管密度（个/mm2）

3 讨论

肾癌的治疗在临床上比较单一，主要是通过手术治疗，对放化疗不敏感免疫治疗在肾癌晚期治疗效果不理想。近几年通过对肾癌的研究，临床上有许多药物诞生，但价格比较昂贵，患者不能承受，笔者通过将si-RNA质粒转导肾癌细胞内，与Control组和GFP组相比较，发现细胞比Control组和GFP组生长缓慢，将三组含有不同质粒的肾癌细胞皮下种植小鼠皮下，建立动物的实验模型，测量三组动物实验模型肿瘤的直径大小，可以直观发现存在siRNA的肾癌的小鼠生长速度明显低于Control组和GFP组，生长速度也明显低于其他两组，Control组和GFP的体积大小以及生长速度明显高于VEGF组。GFP组的生长速度和在体小鼠的肿瘤大小无明显变化，通过免疫组化测量组织血管密度可以看出，三组小鼠组织的血管密度各不相同，其表现差异性很大，在VEGF组中，6只小鼠的血管密度与GFP组、Control组相比均小。在VEGF组的每只小鼠的组织血管密度相差不大，这与siRNA抑制血管内皮生长有很大关系，说明其能抑制肿瘤血管内皮生长的速度，间接抑制肿瘤的生长速度，直观上可见肿瘤大小以及体积远远小于GFP组和Control组。根据以上的实验研究，笔者可以得出siRNA-VEGF具有抑制肾癌细胞的生长作用，为临床起到指导作用，在药物的研发上起指导作用。

血管内皮生长因子属于多潜能因子家族，VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子VEGF的生物学作用是促进血管内皮生长，增加血管的通透性及血管生成维持其功能，此外还有促进内皮细胞的分裂[3]。最后还有细胞质的聚钙作用在正常肾脏可以表达，其含量和病变的程度呈正比[4]。

肿瘤的生长依赖血管以及生长因子的作用，其中VEGF对血管的生长有很大的作用，是决定血管形成的因素之一[5]。VEGF在许多恶性肿瘤组织中高水平表达，肿瘤组织中的高表达VEGF有利于肿瘤的生长与转移，有很多研究显示肿瘤生长组织中VEGF的表达很高[6-7]。在实验中Control组肿瘤细胞生长很快，而在VEGF组肾癌组织生长很慢，血管密度很低，说明VEGF的表达增高与肾癌的生长与侵袭有关。

肾癌是一种很容易转移的肿瘤，在临床上往往转移发生很早，转移的主要方式是淋巴转移和血道转移，其转移是一个很复杂的过程，也是一个动态过程，很多因子参与调控，几近年来发现VEGF是与实体肿瘤生长和转移有很大联系的一组生长因子，是以旁分泌的形式进行分泌，刺激血管形成，间接促进肿瘤的生长，在肿瘤的生长体积以及晚期转移的患者VEGF的表达水平高于早期患者。Oya等[8]报道，肾脏小血管以及小管是通过VEGF子分泌作用促进瘤的增生。在近年的研究中发现，VEGF与相应的疾病有关联，例如肾衰竭、代谢疾病、血管疾病，在不同的肾脏疾病中VEGF的表达不同。但是现在在肾癌的研究中，确定VEGF起着决定性的作用，现在有应用药物的治疗，例如舒尼替尼、索拉菲尼等药物的治疗。应用药物在最大限度上抑制VEGF和扩大潜在的抗肿瘤作用，现对这些药物组合安全性进行评估，所以不难看出，在发现VEGF之后为临床治疗提供了指导思想，为寻找其他有效因子作出了很好的实验模型，在今后肾癌治疗中有很好的指导意义。

[1]肖建武.血管内皮生长因子与肾脏疾病研究进展[J].中国医药指南，2008，6（23）：

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