高效液相色谱法同时对金银花中5种有效成分的含量测定

孟晓岩，丁 勇

1 仪器与方法

1.1 实验仪器 Agilent-1100液相色谱仪(美国安捷伦公司，Agilent-1100系列四元泵，VWD检测器，Agilent Chemstation色谱工作站);XK96-A型快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司);DT-500型电子天平(常熟市衡器厂);AE200型电子分析天平(METTLER TOLEDO公司);SK7200H型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);0.45 μm过滤膜(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 试剂与药品 对照品:绿原酸(753-9003)、咖啡酸(110885-200102)、芦丁(100080-200306)、木犀草苷(111720-200501)，槲皮素(081-9903)均购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯;水为重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件和系统适应性实验 色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。流动相:乙腈-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长:350 nm;柱温:25℃;流速:1 mL/min;进样量10 μL;绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素5个成分峰理论塔板数均不低于3 000，与相邻峰的分离度大于2.0(见图1)，梯度洗脱条件见表1。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸对照品5.2 mg，咖啡酸对照品4.1 mg，芦丁对照品2.6 mg，木犀草苷对照品2.1 mg，槲皮素对照品2.5 mg，置25 mL棕色量瓶中。加10 mL甲醇溶解，超声处理，放冷。加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为绿原酸 208 μg/mL、咖啡酸164 μg/mL、芦丁104 μg/mL、木犀草苷84 μg/mL、槲皮素100 μg/mL的对照品混合溶液。

表1 梯度洗脱条件

图1 金银花供试品、对照品色谱图

2.3 样品溶液的制备 精密称取药材粉末(过40目筛)1 g置于100 mL圆底烧瓶中，精密加水50 mL，称重，加热回流1 h，放冷后再称重，并用水补足重量差，滤过，弃去初滤液，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.4 线性关系考察 精密量取对照品混合溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL 置于 5 mL 容量瓶中，分别加入甲醇定容至5 mL，依次进样10 μL测定，记录色谱峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X)为横坐标，计算得回归方程与线性关系见表2，结果表明，线性关系良好。

表2 线性关系及标准曲线测定结果

2.5 精密度试验 将对照品混合溶液重复进样5次，每次10 μL，记录色谱峰面积。绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素的RSD分别为1.02%、1.09% 、1.26% 、1.18% 、1.02% 。

2.6 重复性试验 精密称取1 g金银花样品5份，按“2.1”项下方法测定并计算含量。金银花样品中绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素的RSD(n=5)分别为 1.12%、1.23%、1.25%、1.20%、1.10%。说明方法可靠，重复性良好。

2.7 稳定性试验 取对照品混合溶液，在0.5、2、4、6、8、10 h 进样 10 μL，分别记录 6 种成分的峰面积，绿原酸RSD为1.06%，咖啡酸RSD为1.10%，芦丁RSD为1.19%，木犀草苷RSD为1.20%，槲皮素RSD为1.05%。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的药材粉末约0.5 g，精密加入高、中、低浓度的混合对照液，每个浓度各做3份，按“2.1”项下方法，测定结果绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素的回收率分别为 97.50%(RSD=0.18%)、98.42%(RSD=0.44%)、99.30%(RSD=0.60%)、100.21%(RSD =0.26%)、99.44%(RSD=0.37%)。HPLC法同时测定金银花中5种有效成分的准确度，见表3～表7。

2.9 样品测定 取3批金银花，按“2.3”项制得供试品液，分别将对照品溶液和供试品液注入液相色谱仪，进样量为10 μL，记录色谱峰面积，外标法计算含量。测定结果见表8。

表3 绿原酸对照品原液(208.0 μg/mL)

表4 咖啡酸对照品原液(164.0 μg/mL)

表5 芦丁对照品原液(104.0 μg/mL)

表6 木犀草苷对照品原液(84.0 μg/mL)

表7 槲皮素对照品原液(100.0 μg/mL)

表8 样品测定结果(%，n=2)

3 讨论

3.1 测定波长的选择 对绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素对照品和金银花样品的70%乙醇提取液进行190～400 nm的紫外全波长扫描。绿原酸的最大吸收波长为327 nm，可接受检测波长范围280～360 nm;芦丁的最大吸收波长为355 nm，可接受检测波长范围325～375 nm;木犀草苷的最大吸收波长为350 nm，可接受检测波长范围325～375 nm;槲皮素的最大吸收波长为370 nm，可接受检测波长范围360～390 nm。

由于当1个样品中有数种UV图谱不同的被测物时，不可能在最大波长处检测各化合物。A＜0.1时，甚至在吸收谱带陡坡上进行检测，通常也符合线性关系。根据以上4种被测物的全波长扫描图，选择350 nm为4种物质同时测量的检测波长。咖啡酸在350 nm也有较大吸收，故选择350 nm为检测波长。

3.2 流动相的确立 金银花中干扰成分众多，样品的处理及流动相的选择都很重要。已有研究选择不同［3-5］的流动相，分离效果均不理想。最后选用本文方法，确立最终流动相，即乙腈-0.4%磷酸水溶液。

3.3 本实验建立的绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素在同一色谱条件下进行分析测定，可大大节省分析时间，提高效率。

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