富硒灵芝超微粉抗肿瘤及免疫调节功能研究

李秋涵，洪志丹

目前，恶性肿瘤的主要治疗方法包括外科手术、放疗、化疗等。具有免疫调节功能的中药在巩固和加强抗肿瘤药的治疗效果、延长患者的生命和改善生存质量方面显现出了巨大的优越性［1-2］。灵芝作为传统中药具有调节机体免疫功能的作用，本文研究了富硒灵芝超微粉的抗肿瘤作用及其对机体免疫功能的影响。

1 实验材料

1.1 动物 昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄兼有(每批试验用一种性别)，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(军)2007-004。

1.2 瘤株及细胞株 肉瘤S180瘤株、肝癌H22瘤株，沈阳市肿瘤研究所提供，昆明种小白鼠保种。

1.3 药品与试剂 富硒灵芝超微粉，沈阳德寰灵芝种植基地提供。室温干燥处保存，临用前用蒸馏水溶解并稀释至所需浓度。参一胶囊，吉林亚泰制药有限公司生产;环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司。

1.4 主要仪器 FA/JA1004系列上皿电子天平:上海精科天平仪器厂;PH050A型培养箱/干燥箱:上海一恒实验仪器有限公司;XDS-1B型倒置生物显微镜:重庆光电仪器总公司。

2 实验方法

2.1 对小鼠移植性肉瘤S180生长的影响 无菌操作，取传代7d的荷S180小鼠腹水，细胞计数，用0.9%生理盐水稀释至浓度为2×107个/mL，每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL。次日，按体质量随机分为5组，分别为富硒灵芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg剂量组与阳性对照组(市售参一胶囊5.2 mg/kg)、模型(对照)组。各给药组连续给药15d，模型对照组灌胃给予蒸馏水。约药体积为20 mL/kg。末次给药后24 h，颈椎脱臼处死动物，分别称体质量、瘤重，计算抑瘤率，进行疗效评价［3-4］。结果用Excel软件进行统计学处理，该实验重复3批。结果显示，富硒灵芝超微粉剂量依赖性地抑制移植性肉瘤S180生长，且给药组小鼠体质量稳定增长。见表1。

2.2 富硒灵芝超微粉对小鼠移植性肝癌H22生长的影响 无菌操作，取传代7d的荷肝癌H22小鼠腹水，细胞计数，用0.9%生理盐水稀释至浓度为2×107个/mL，每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL(4×106个/只)。次日按体质量随机分为5组并给药(给药方法同“2.1”项)。给药体积为20 mL/kg。末次给药后24 h，颈椎脱臼处死动物，分别称体质量、瘤重，计算抑瘤率，进行疗效评价［5］。结果用Excel软件进行统计学处理，该实验重复3批。结果显示，富硒灵芝超微粉剂量依赖性地抑制移植性肝癌H22的生长，且给药组小鼠体质量稳定增 长。见表2。

表1 富硒灵芝超微粉对小鼠移植性肉瘤S180生长的影响(，n=3)

表1 富硒灵芝超微粉对小鼠移植性肉瘤S180生长的影响(，n=3)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。抑瘤率=(模型组瘤重-给药组瘤重)/模型组瘤重×100%

批次 组别 剂量(g/kg) 动物数(只)体质量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)开始 结束 开始 结束1 10 9 20.5±1.18 28.3±2.75 1.536±0.333参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 20.3±1.36 28.8±2.89 1.023±0.265＊＊ 33.4富硒灵芝超微粉组 1.04 10 10 20.1±1.43 27.7±3.29 1.071±0.350＊＊ 30.3 0.52 10 10 19.6±0.79 26.1±1.91 1.123±0.313＊＊ 26.9 0.26 10 9 20.5±1.33 27.9±2.21 1.209±0.221* 21.3 2模型组 10 10 19.6±1.30 27.5±2.32 1.602±0.467参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 19.5±0.88 27.0±1.84 1.040±0.572＊＊ 35.1富硒灵芝超微粉组 1.04 10 10 19.6±0.81 26.6±1.34 1.162±0.369＊＊ 27.5 0.52 10 10 19.0±0.83 26.5±1.33 1.305±0.488* 18.5 0.26 10 10 19.5±1.12 27.6±1.81 1.427±0.465 10.9 3模型组 10 10 19.8±0.69 26.9±2.69 1.745±0.659参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 19.8±0.95 26.8±1.48 1.057±0.441＊＊ 39.4富硒灵芝超微粉组 1.04 10 10 19.2±0.81 27.4±1.28 1.203±0.421＊＊ 31.1 0.52 10 10 19.3±0.58 27.3±2.80 1.257±0.486* 27.9 0.26 10 10 19.5±0.89 26.4±1.17 1.457±0.438 16模型组.5

表2 富硒灵芝超微粉对小鼠移植性H22肝癌生长的影响(±s，n=3)

表2 富硒灵芝超微粉对小鼠移植性H22肝癌生长的影响(±s，n=3)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

批次 组别 剂量(g/kg) 动物数(只)体质量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)开始 结束 开始 结束1 10 9 19.7±0.73 25.7±2.73 1.678±0.724参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 19.5±0.82 26.2±1.90 1.027±0.290＊＊ 38.8富硒灵芝超微粉组 1.04 10 10 19.3±0.65 26.9±1.52 1.106±0.413＊＊ 34.1 0.52 10 10 19.2±0.62 26.7±1.67 1.235±0.311* 26.4 0.26 10 10 19.7±0.79 25.5±1.83 1.476±0.459 12.0 2模型组 10 9 19.6±1.05 26.8±2.06 2.131±0.858参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 19.4±1.11 26.2±2.07 1.264±0.695＊＊ 40.7富硒灵芝超微粉组 1.04 10 9 19.8±0.85 26.8±1.18 1.413±0.622＊＊ 33.7 0.52 10 10 19.7±0.91 26.2±1.58 1.652±0.563* 22.5 0.26 10 10 19.5±1.04 26.7±1.70 1.858±0.723 12.8 3模型组 10 10 20.1±1.36 27.6±2.94 2.089±0.647参一胶囊组 5.2×10-3 10 10 20.8±1.24 28.5±2.98 1.360±0.558＊＊ 34.9富硒灵芝超微粉组 1.04 10 10 20.2±1.32 26.5±3.24 1.441±0.537* 31.0 0.52 10 10 19.8±1.05 26.7±1.29 1.507±0.326* 27.8 0.26 10 10 20.2±1.37 27.9±2.85 1.750±0.654 16模型组.2

2.3 富硒灵芝超微粉对荷肉瘤S180小鼠脾脏及胸腺指数的影响 无菌操作，肉瘤S180的接种及分组同“2.1”，另设不接瘤的空白对照组。实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取其脾脏及胸腺，称重，计算脾脏指数及胸腺指数。脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)重量/体质量 × 10［6］。各组结果用 Excel软件进行统计学处理。结果显示，模型组小鼠脾脏及胸腺指数较空白对照组显著降低;与模型对照组比较，富硒灵芝超微粉1.0、0.52 g/kg能够显著增强荷肉瘤S180小鼠的脾脏指数，富硒灵芝超微粉1.04 g/kg能够显著增强荷肉瘤S180小鼠的胸腺指数。见表3。

表3 富硒灵芝超微粉对荷肉瘤S180小鼠脾脏指数及胸腺指数的影响()

表3 富硒灵芝超微粉对荷肉瘤S180小鼠脾脏指数及胸腺指数的影响()

注:与模型组比较，*P＜0.05;与空白对照组比较，#P＜0.05

组别 剂量(g/kg)动物数(只)脾脏指数(mg/10g)胸腺指数(mg/10g)10 129.6±24.04 37.3±9.28模型组 10 101.4±29.84# 29.5±4.94#富硒灵芝超微粉 1.04 10 134.4±24.29* 39.1±8.34*0.52 10 131.4±28.76* 35.1±6.93 0.26 10 104.8±21.81 33.5±6.72参一胶囊 5.2×10-310 132.8±24.30* 38.8±8.86空白对照组*

2.4 富硒灵芝超微粉对荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 无菌操作，肝癌H22的接种及分组同“2.2”，另设不接瘤的空白对照组。于实验前3d，每只鼠腹腔注射0.2 mL 4%的淀粉生理盐水溶液，诱发腹腔的无菌性炎症。于实验日，颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇全身浸泡消毒，向小鼠腹腔内注入5 mL预冷的PBS，腹部按摩，抽取腹腔细胞悬液约4 mL。将悬液转入离心管中，1 500 r/min、4℃离心5 min，弃去上清，再用 PBS清洗1次。将细胞转入盛有含10%FBS的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×106个/mL。以100 μL/孔加入 96 孔板中，置 5%CO2、37 ℃ 培养箱培养2 h后，甩弃上清，用PBS清洗96孔板3次，将孔内液体甩干。每孔加入0.075%的中性红溶液100 μL，置5%CO2、37 ℃培养箱培养 1 h，取出培养板，甩弃中性红。用PBS清洗96孔板4次，加入乙醇∶冰醋酸(1∶1)100 μL，静置过夜，用酶标仪测540 nm处的OD值［7-8］。各组结果用Excel软件进行统计学处理。结果显示，模型组小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬中性红的能力较空白对照组显著降低;与模型组比较，富硒灵芝超微粉1.04、0.52 g/kg能够显著增强荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬中性红的能力。见表4。

表4 富硒灵芝超微粉对荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响()

表4 富硒灵芝超微粉对荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响()

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与空白对照组比较，##P＜0.01

组别 剂量(g/kg) 动物数(只)OD值(540 nm)10 0.552±0.085模型组 10 0.285±0.071##富硒灵芝超微粉 1.04 10 0.484±0.053＊＊0.52 10 0.352±0.068*0.26 10 0.203±0.027参一胶囊 5.2×10-3 10 0.435±0.054空白对照组＊＊

2.5 富硒灵芝超微粉对免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影响 选取健康昆明种小鼠60只，随机分为6组，分别为富硒灵芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg剂量组及参一胶囊5.2 mg/kg组、模型组(给予环磷酰胺)及空白对照组。各组连续给药，于给药第5天，给每只鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2 mL。除空白对照组外，其余各组分别于第4天、第9天，按75 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺，造成免疫功能低下模型。连续给药10d，第11天进行实验。各组小鼠眼底静脉丛取血，离心分离血清，用生理盐水将血清稀释50倍，取稀释血清1 mL加入反应管中，再加入0.5%鸡红细胞悬液0.5 mL，然后在冰水中加入0.5 mL补体(10%3只豚鼠混合血清)，将反应管中溶液摇匀，置于37℃恒温水浴中反应30 min，反应过程中振摇2次，反应结束后将反应管置于0℃冰箱中终止反应。离心，取上清液于722型分光光度计540 nm处比色，测定吸光度(以不加小鼠血清的空白对照管调0)，以上清液的吸光度代表小鼠血清溶血素水平的高低［9］。各组结果用Excel软件进行统计学处理。结果显示，模型组小鼠血清溶血素水平较空白对照组显著降低;与模型组比较，富硒灵芝超微粉1.04、0.52 g/kg能够显著提高小鼠的血清溶血素水平，改善环磷酰胺对小鼠血清溶血素水平产生的抑制作用。见表5。

表5 富硒灵芝超微粉对免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影响()

表5 富硒灵芝超微粉对免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影响()

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与空白对照组比较，##P＜0.01

组别 剂量(g/kg) 只 OD值(540 nm)空白对照组 —10 0.445±0.040模型组 CTX 75 mg/kg×2次 10 0.128±0.049##富硒灵芝超微粉+CTX 1.04 10 0.350±0.083＊＊0.52 10 0.259±0.091*0.26 10 0.100±0.030参一胶囊+CTX 5.2×10-3 10 0.354±0.078＊＊

3 讨论

本文采用的移植性肿瘤模型，是考察药物抗肿瘤作用的典型体内实验模型。模型的优点在于能够保持机体的完整性，并使机体与外界环境保持正常的联系，因此，能更加客观地反映药物的抗肿瘤活性［11］。本研究表明，富硒灵芝超微粉能够显著降低荷肉瘤S180、肝癌H22小鼠的平均瘤重，确定了其具有抗肿瘤活性。通过观察免疫系统多个指标的变化，考察了富硒灵芝超微粉对机体免疫功能的影响，结果表明，富硒灵芝超微粉通过影响免疫系统的不同环节而增强机体免疫功能，从而产生抗肿瘤活性。

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