GeneFinderTM 核酸染料对玉米花粉管通道导入路径的研究

刘芳，黄立楠

（大庆油田农场，大庆163458）

花粉管通道法（pollen tube pathway）是由我国科学家周光宇首先提出和设计的[1-4]。20世纪70年代以来，花粉管通道法在改良玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等多种作物的高产、优质及抗性等方面得到了广泛的应用，大量试验结果表明，外源DNA 通过该途径导入受体后，不仅出现广泛变异，并在一些作物中已选育到优良的稳定遗传新品系[5]。然而花粉管通道法转化技术的关键在于花粉管通道的导入路径，本文将选用一种新的试验方法，即通过GeneFinderTM核酸染料对外源DNA 导入路径进行观察和分析。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

供体：高粱（吉甜粱2 号系）；受体：玉米（Zea mays L.）优良自交系4112。供试材料高粱和玉米分别由吉林省农业科学院作物育种研究所和玉米所提供。

荧光染料为核酸染料GeneFinderTM（百维信生物科技有限公司，厦门，中国），该染料属于花青类染料，毒性很低，使用安全，可有效保护实验操作者和环境。GeneFinderTM与dsDNA 结合荧光信号可增强800～1 000 倍，其检测核酸的灵敏度比EB 染色法平均高10 倍左右，具有安全、灵敏、经济的特点，在紫外透射光下双链DNA 与该染料结合呈现绿色荧光。

1.2 花粉管通道导入外源总DNA 技术

采用CTAB 法提取供体材料的总DNA[6]，供体高粱用于外源DNA 导入工作的溶液浓度为10 ng ·mL-1。

随机选取一株自交授粉后24 小时的玉米果穗，平齐剪去距穗轴顶部1 cm 以上的苞叶和花丝，将其分成两份，将混有荧光染料（GeneFinderTM）供体高粱的总DNA 溶液滴在一份剪齐的花丝上，每穗滴0.5 mL。分别于8、22 h 采摘若干花丝与未加入染料的授粉花丝（CK）通过紫外成像仪进行对比试验。

2 结果与分析

2.1 外源DNA 导入8 h 后对导入路径观察

从图1 可以看出，未进行外源DNA 导入的花丝通过紫外成像仪可观察到，花丝整体灰暗且分布均匀一致，说明花粉蛋白要与柱头蛋白已经相互识别，经过一段时间后，将会萌发出花粉管，当授粉8 h 后玉米花丝已形成花粉管通道，但却无外源DNA 导入，因此花丝较暗；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花丝在接近滴入口1～3 cm 处的位置有亮点出现，说明外源导入8 h 后含有GeneFinderTM 外源DNA 已经渗入到了花粉管通道中，此时正从滴入口沿花粉管通道向胚囊方向运行。由于玉米授粉后花丝个体之间的差异，外源DNA 导入后并非所有花丝滴入口均能呈现亮点，因此图中2 号花丝通过外源DNA 导入技术后整体花丝仍较暗，说明2 号花丝没有成功导入外源DNA。

图1 外源导入8 h 后的花丝对比结果Fig.1 Contrast result of filament after 8 h outside introduction

2.2 外源DNA 导入22 h 后对导入路径观察

从图2 可以看出，未进行外源DNA 导入的花丝通过紫外成像仪观察仍呈现整体灰暗的现象，说明没有外源DNA 导入的花丝在授粉后的任何时期内在亮度上都不会发生太大的变化；而被滴入含有GeneFinderTM的外源DNA 的花丝，从整体上看亮度几乎分布均匀一致（3 号花丝因外力碾压，所以花丝表面部分萎蔫），说明授粉22 h 后含有GeneFinderTM外源DNA 正沿花粉管通道向胚囊方向运行了很长距离。

图2 外源导入22h 后的花丝对比结果Fig.2 Contrasting result of filament after 22 h outside introduction

3 讨论与结论

3.1 花粉管通道形成的过程

在温度为25～30℃以及相对湿度为85%以上的情况下，玉米花粉落到花丝上10 min 以后就开始发芽，30 min 左右大量发芽[7]。花粉水合，进而释放花粉蛋白与柱头蛋白相互识别，亲和的花粉便可以萌发产生花粉管。花粉管通过花柱而达子房的生长途径可分为两种不同的情况：一些植物的花柱中间成空心的花柱道，花粉管在生长时沿着花柱道表面下伸，到达子房；另一种情况是花柱并无花柱道，而为特殊的引导组织或一般薄壁细胞所充塞，花粉管生长时需经过酶的作用，将引导组织或薄壁组织细胞的中层果胶质溶解，花粉管经由细胞之间通过。花粉管到达子房以后，在子房壁内表皮和胎座的表面生长，遇到珠柄后，沿珠柄转向胚珠表面生长，到达珠孔处，花粉管经珠孔进入胚囊[8]。

目前在花粉管通道导入技术成败的关键因素中，最主要的是外源DNA 的导入路径和导入后的整合问题，而花粉管是连接柱头与胚囊之间唯一的结构，又因其栓塞结构的存在，使得花粉管成为一个不连续的系统，所以它不可能运转外源DNA，而花粉管的外表面则可成为溶液物质转移的唯一连续界面，此时外源DNA 溶液就会沿着连接柱头与胚囊的花粉管外界面渗入胚囊。从某种意义上来讲，外源DNA溶液的导入部位离胚囊越近，越有利于外源DNA 的渗入，为此花粉管必须先形成，而后才能导入外源DNA。但事实上，由于玉米授粉后花丝个体之间的差异，该导入技术并非使玉米的全部花丝均能成功导入外源DNA，因此，只能说在严格规定导入时间及技术手段的前提下，外源DNA 导入技术能成功导入绝大部分玉米花丝。

3.2 花粉管通道导入路径的研究进展

龚蓁蓁等[9]将花粉管通道的转化机理归结为棉花受精时所形成的自珠孔到胚囊之间的花粉管通道，外源DNA 由此通道进入胚囊。邓德旺等[10]认为，外源DNA 导入的途径为花粉管外通道，经胎座上部传输组织束中的花粉管外缝隙胎座表面、珠孔、珠心通道进入胚囊。曾君祉等[11]认为，外源DNA 引入运行的花粉管内，使之有机会参与受精过程，达到转化的目的。花粉管生长途径的有关组织结构的研究结果表明，通过花粉管的生长可以产生所谓的花粉管通道。

3.3 结论

本文运用一种新的试验方法，通过荧光染料与dsDNA 结合在紫外成像仪下呈现绿色荧光的特点，来观察授粉后不同时期外源DNA 在花丝内通过路径的变化。以授粉的玉米花丝为对照，外源导入8 h后外源DNA 从滴入口方向开始向胚囊方向运行，而外源导入22 h 后整个花丝都呈现亮度整体一致的现象，说明此时外源DNA 已向胚囊方向运行了很长一段距离，经过一段时间后，可能到达子房，这与刘金元等[12]的试验结论一致。

［1］ 周光宇.从生物化学的角度探讨远缘杂交的理论［J］.中国农业科学，1978（2）:16-20.

［2］ 周光宇.远缘杂交的分子基础—DNA 片段杂交假说的一个论证［J］.遗传学报，1979，6（4）:405-412.

［3］ Zhou GY，Weng J.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos ［J］.Methods in Enzymology，1983，101:433-481.

［4］ 周光宇，翁坚.农业分子育种—授粉后外源DNA 导入植物技术［J］.中国农业科学，1988，21（3）:1-6.

［5］ 周光字，翁坚，龚蓁蓁，等.农业分子育种—授粉后外源DNA 导入植物的技术［J］. 中国农业科学，1988，21（3）:5-6.

［6］ Saghai-Maroof M.A.，Soliman K.M.，Jorgensen R.A.，et al.Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley:mendelian inheritance，chromosomal location and population dynamics［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.，1984，81:8014-8018.

［7］ 颜启传.种子学［M］.北京:中国农业出版社，2001.

［8］ HU SH Y，SHEN J H.On the process of fertilization in cotton and its duration of each stage［J］.Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis （Nat.Sci.Edi），1980（1）:75-87.

［9］ GONG ZH ZH，SHEN W F，ZHOU G Y，et al.Technique of transformation exogenous DNA into plant after pollination-DNA fragments were transferred in to embryos via pollen tube［J］.Science in China，1988（6）:611-614.

［10］ DENG D W，GUO S D ，YANG ZH M.Study on the molecular cytological mechanism of cotton transformation by pollen tube pathwa ［J］.Scientia Agricultura Sinica，1999，32（6）:113-114.

［11］ ZENG J Z，WU Y Q，WANG D J，et al.Genetic expression in progeny of transgenic plants obtained by using pollentube pathway （or delivery）method and approach to the transformation mechanism［J］.Chinese Science Bulletin，1998，43（6）:561-566.

［12］ 刘金元.利用显微放射自显影技术检测外源DNA 导入玉米的研究［J］.核农学通报，1994，15（2）:70-72.