玉米胚芽蛋白酶解工艺条件优化研究

丁继峰，张东杰

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319；2.黑龙江省友谊县食品药品监督管理局）

玉米胚芽中含有丰富的脂肪和蛋白成分，玉米胚芽脱脂后得到的残渣约含有23%～35%的粗蛋白。玉米胚芽蛋白是一种良好的蛋白资源，有着广阔的发展潜力。玉米胚芽蛋白富含人体所必需的氨基酸，其氨基酸组成及生物效价与鸡蛋白相似，高于一般的谷物蛋白，与WHO/FAO推荐的人类蛋白质标准值相近，营养价值较高且价格低廉，是一种可以替代大豆蛋白的理想优质蛋白资源[1-2]。

玉米胚芽蛋白具有良好的持水性、持油性和乳化性，添加到食品中可以改善食品的质地及组织特性。目前多采用碱溶酸沉法从玉米胚芽中提取玉米胚芽蛋白，吴冬青、张鸣镝和李宝玉等人通过数学模型条件优化提取玉米胚芽蛋白的最佳条件，考察加水量、pH、温度、浸提时间对玉米胚芽蛋白提取的影响[3-6]。连玉新等用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白大豆分离蛋白质量分数为5.6%、酶用量为5 000 U·mL-1、反应温度为51℃、反应时间为117min，该条件下得到改性后大豆分离蛋白的乳化活性为1.390[7]。翟爱华等人利用碱溶酸沉法制备南瓜籽芽蛋白粉的工艺条件。实验结果表明:制备南瓜籽芽分离蛋白的最佳条件为液料比40∶1、提取温度43℃、提取时间2 h、pH10.6。该条件下预测蛋白纯度达到96.64%，实际测得蛋白纯度为94.79%[8]。近年来，国内多用酶解技术分离植物蛋白多肽，水解制备得到的肽提取效率高，食用安全性高。常用采用单一蛋白酶或者几种酶联合复配。试验采用木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白进行酶解，并对酶水解的温度、pH、酶解时间、酶添加量等水解条件进行探讨，旨在优化得出玉米胚芽蛋白的最佳水解参数。

1 实验材料与实验方法

1.1 实验原料

自制玉米胚芽蛋白粉：蛋白质纯度61.86%。

1.2 实验仪器

电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；DJIC-60W精密定时电动搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DELTA 320酸度计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司制造；DK-S24电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；RE52-98旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵：巩义市英裕予华仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱：上海森信试验仪器有限公司；万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DZF-6020真空冷冻干燥机：上海一恒科学有限公司；LD4-8离心机：北京京立离心机有限公司。

1.3 实验试剂

氢氧化钠、盐酸（分析纯）、木瓜蛋白酶（NOVO公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验原料预处理

实验室通过超临界CO2萃取制备脱脂玉米胚芽粉，再经过碱溶酸沉法提取玉米胚芽蛋白备用。

1.4.2 工艺流程

玉米胚芽蛋白→与水混合→调节pH→加入木瓜蛋白酶→水解→记录耗减量→水解度测定

1.4.3 水解度的测定

水解度的测定采用pH-Stat法，水解度的计算公式按下式计算：

式中：h——单位质量蛋白质中被水解的肽键的量（mmoL·g-1）；

htot——单位质量蛋白质中肽键的总量（mmoL·g-1），玉米胚芽蛋白htot=8.38mmoL·g-1；

B——水解过程中所消耗的碱量（mL）；

Nb——碱液的浓度（moL·L-1）；

MP——水解液中蛋白质的质量（g）；

1/α——校正系数。

2 结果与讨论

2.1 玉米胚芽蛋白水解单因素试验

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量对玉米胚芽蛋白水解效果的影响

图1 酶添加量对水解度的影响Fig.1 Effectof enzyme concentration on hydrolysis

木瓜蛋白酶添加量对玉米胚芽蛋白水解效果的影响趋势如图1所示，随着木瓜蛋白酶添加量的逐渐增大，玉米胚芽蛋白水解度也逐渐增大，[E]/[S]值小于2%时，玉米胚芽蛋白水解物的水解度增大较快，但[E]/[S]值大于2%后，对玉米胚芽蛋白水解效果的影响差别较小，基本趋于平衡，说明继续加大酶添加量不能使酶促进程加快，从经济角度衡量，选择酶添加量为2%较为合适。

2.1.2 水解温度对玉米胚芽蛋白水解效果的影响

图2 水解温度对水解度的影响Fig.2 Effectof temperature concentration on hydrolysis

水解温度对玉米胚芽蛋白水解效果的影响趋势如图2所示，随着水解温度的升高，玉米胚芽蛋白水解度先迅速增大后逐渐减小，在水解温度为60℃时，水解度达到最大，继续温度继续升高，水解度反而降低，由此说明水解温度较低时，木瓜蛋白酶活性较低，不能与底物完全结合发生反应，而温度过高不但会使酶失活，同时也会使部分玉米胚芽蛋白发生变性，使得反应底物减少，从而导致反应速率下降，因此，木瓜蛋白酶水解的最佳温度为60℃。

2.1.3 水解时间对玉米胚芽蛋白水解效果的影响

图3 水解时间对水解度的影响Fig.2 Effectof time concentration on hydrolysis

水解时间对玉米胚芽蛋白水解效果的影响趋势如图3所示，随着水解时间的延长，玉米胚芽蛋白水解度逐渐增大，在3 h后基本达到平衡，由图可以看出水解时间对玉米胚芽蛋白水解物的水解度影响较为显著，随着水解时间的延长，木瓜蛋白酶与底物充分接触，酶解反应完全，肽键断裂较完全。因此，木瓜蛋白酶水解的最佳时间为3 h。

2.1.4 水解pH对玉米胚芽蛋白水解效果的影响

图4 pH对水解度的影响Fig.4 Effectof pH concentration on hydrolysis

不同pH对玉米胚芽蛋白水解效果的影响趋势如图4所示，随着pH的增大，玉米胚芽蛋白水解度变化显著，pH为6.5时，玉米胚芽蛋白水解物的水解度最大，pH过大或者过小都不利于木瓜蛋白酶的酶解效果，使酶促反应不能正常进行，与此同时，pH的改变也可能使得玉米胚芽蛋白的结构状态发生改变。因此，木瓜蛋白酶酶解的最适pH为6.5。

2.2 玉米胚芽蛋白水解条件的优化

根据以上单因素试验的结果进行四元二次回归正交旋转组合设计实验，并采用SAS软件对结果进行处理分析，试验设计及结果见表1。

表1 试验设计及结果Table1 Design and results of experiment

续表1试验设计及结果Continued Table1 Design and results of experiment

对实验数据进行回归分析，以玉米胚芽蛋白水解物的水解度作为衡量指标即Y值，得到以四种影响因素的编码值为自变量的回归方程如下：

回归方程的方差分析及F检验结果见表2：

表2 F检验分析表Table2 F testanalysis

回归方程显著性分析结果：F回归=40.61＞F0.01=3.03，说明差异极显著。F失拟=1.80＜F0.05=2.85，说明差异不显著；对回归方程显著性检验：R2=S回/S总=0.964 4。回归方程的拟合性较好。对回归方程进行模拟寻优，得到水解玉米胚芽蛋白的最佳条件为：木瓜蛋白酶添加量2.09%，水解温度60.05℃，水解时间2.99 h，pH6.42，理论水解度为13.65%。根据实际操作情况，选择在木瓜蛋白酶添加量2.1%，水解温度60℃，水解时间3 h，pH6.4条件下进行三次验证，实际水解度平均值为13.52%，误差为≤5%，说明优化模型拟合较好。

3 结论

试验采用木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白进行水解，以水解度为衡量指标，考察了木瓜蛋白酶的添加量、水解温度、水解时间和pH四个单因素对玉米胚芽蛋白水解效果的影响，兵在单因素基础上进行四元二次回归正交旋转组合设计实验，经过优化级实际操作情况，最终确定玉米胚芽蛋白水解的最佳条件为：木瓜蛋白酶添加量2.1%，水解温度60℃，水解时间3 h，pH6.4，此实验条件验证，实际水解度为13.52%。

[1]Brown L M，Zayas J.F.Corn germ protein flour as an extender in broiled beef patties[J].Journal of food science，1990，55：888-892.

[2]Kulakova E V，Vainerman E S，Rogoshin SV.Contribution to the investigation of the corn germ Part I.Corn germ as a valuable source of protein[J].Nahrung，1982，26：451-456.

[3]吴冬青，于丹丹，后丽丽，等．碱法提取玉米胚蛋白工艺的研究[J]．粮油食品科技，2006，14（1）：36-37.

[4]张鸣镝，姚惠源．提高玉米胚蛋白浸出率的工艺研究[J]．农业工程学报，2006，22（5）：226-228.

[5]李宝玉，代小容．玉米胚分离蛋白提取及影响收率因素的初探[J]．山东食品发酵，2008（3）：16-18.

[6]张鸣镝，王章存．响应面分析法优化玉米胚芽蛋白的提取工艺研究[J]．农产品加工：学刊，2008（7）：174-177.

[7]连玉新，张东杰，王颖．响应面法优化酶改性大豆分离蛋白条件的研究[J]．黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（2）：65-70.

[8]翟爱华，王迪，王宪青，等．响应面法优化南瓜籽芽蛋白粉的碱法制备工艺[J]．黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（5）：69-75.