AQP-3在SD大鼠正常骨骼肌中的表达

邵先舫，李 前，李 莹，严 望

（1.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 410005；2.湖南中医药大学附属一医院，湖南 长沙 410007）

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是广泛存在于动植物和微生物中的一类小分子疏水性跨膜蛋白，其生理功能是选择性通透水。到目前为止，人们已在哺乳动物中发现并克隆了13种水通道蛋白（AQP0-12）。不同的AQP家族具有特异的组织分布并参与特定的生理功能[1]。AQP-3最先是在小鼠肾脏中提取[2]，随后发现在结肠、肝、胰腺、肺、前列腺、脾和皮肤中均有表达。AQP-3除了可通透水外，还可选择性通透甘油和尿素，在机体体液平衡中发挥重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法，观察AQP-3在SD大鼠正常骨骼肌中的表达，为深入研究AQP-3在骨骼肌正常及病理状态下的表达和生理作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料

收集8只6月龄SD大鼠左后肢外侧股四头肌肌群中约200 mg肌肉组织，无菌生理盐水冲洗去除表面血液，分两份，每份约100 mg，置入2 mL冻存管中，迅速保存于液氮中，后转入-80℃冰箱中备用。

1.2 实时荧光定量PCR检测

总RNA提取：样本用液氮在研钵中研磨成粉状，提取标本总RNA，并溶于DEPC水，各标本总RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测其质量；以DEPC水作空白对照，用紫外分光光度仪测定RNA浓度及样本A260与A280比值，检测其纯度。每个样本分别取1 μg总RNA进行逆转录。cDNA的合成：选用Random hexamer primer 1 μL，加无核酶水至12 uL；5×reaction buffer 4 μL， RiboLockTM RNase Inhibitor（20u/uL）1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，RevertAid TM M-MuLV Reverse Transciptase（200 u/uL）1 μL，总反应体系为20 μL。经25℃ 5 min、42℃60 min、70℃ 5 min后逆转录为cDNA，置于-80℃冰箱中保存备用。本实验选用GAPDH为内参基因，其上游引物序列5'-GTG GAG TCT ACT GGC GTCTT-3'，下游引物序列5'-TTG CTG ACA ATC TTG AGGG-3'；AQP3上游引物序列5'-GTG CTG GCC ATT GTT GAC C-3'，下游引物序列5'-GGC CAG CTT CAC ATT CTC T-3'；采用ABI 7500 Real time PCR仪配制单基因单模板20 μL反应体系；扩增条件：95℃，预变性7 min，95℃10 s，55℃（收集荧光）30 s，共40个循环；每个cDNA模板、每个基因重复3次，以内参基因GAPDH为参照，目标基因AQP-1扩增结果以2-△△CT表示，得出（±s）。

1.3 Western blot分析

1.3.1 细胞膜蛋白的提取 将50 mg肌肉组织放入研钵中，加入液氮不断研磨成粉状，然后将粉末置入1 mL的组织裂解液中，充分混匀后置于冰上裂解30 min，放入离心机中以4℃、10000 g离心5 min，取上清液使用BCA法测蛋白浓度。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制10%SDS-PAGE凝胶，浓缩胶5%，取50 μg蛋白质样品，加入等体积上样缓冲液中，经100℃沸水中煮5 min，上样后在凝胶上加85 V电压稳压电泳30 min，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到130 V继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部（约1.5 h）。硝酸纤维素膜（NC膜）100 V湿转70 min；5%脱脂奶粉室温封闭2 h，待用。

1.3.3 免疫印迹 将封闭的NC膜用TBS-T漂洗2次，加入用5%脱脂奶粉稀释（浓度为1:500）的AQP 3多克隆抗体中，4℃下反应过夜，TBS-T漂洗NC膜10 min×3次，加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温下孵育60 min，TBS-T漂洗NC膜10 min×3次，最后经ECL发光液显影。采用凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测

大鼠骨骼肌组织中AQP-3 mRNA表现出稳定扩增状态。各检测样品间AQP-3 mRNA的表达量，比较差异无统计学意义（P＞0.05）。内参基因GAPDH和AQP-3mRNA的溶解曲线如下，提示未出现非特异性扩增。结果见图1-3。

图1 AQP-3 mRNA在大鼠正常肌肉组织中的表达

图2 GAPDH溶解曲线

图3 AQP-3 mRNA溶解曲线

2.2 Western blotting检测

骨骼肌组织中细胞膜蛋白AQP-3在36KD处显示特异性条带，且所有样本的条带灰度值差异无统计学意义（P＞0.05），提示AQP-3在骨骼肌中稳定表达。结果见图4。

图4 AQP-3在大鼠正常肌肉组织中的表达

3 讨论

AQP-3是水通道蛋白家族中对水-甘油共同转运的疏水性细胞膜蛋白，Wakayama Y等人通过研究在基因和蛋白水平证实了AQP-3在人骨骼肌中的存在，在形态学上AQP-3表达主要位于骨骼肌细胞膜的内表面[3]。

本实验结果表明，在大鼠骨骼肌组织中均有AQP-3基因和蛋白质表达，提示AQP-3可能参与大鼠骨骼肌组织内液体平衡，在促进大鼠骨骼肌水代谢、维持骨骼肌液体平衡方面可能有重要作用。AQP-3在骨骼肌钝挫伤后骨骼肌组织中的表达情况及生理作用有待进一步研究。

[1]杨宝学,赵雪俭.水通道蛋白研究进展[J].中国病理生理杂志,2005,21(8):1 619-1 622.

[2]Ishibashi K,Sasaki S,Fushimi K,et al.Molecular cloning and expression of a member of the aquaporin family with permeability to giycerol and urea in addition to water expressed at the basolateral membrane of kidney collecting duct cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,9(1):6 269-6 273.

[3]Wakayama Y,Jimi T,Inoue M,et al.Expression of Aquaporin 3 and its Localization in Normal Skeletal Myof i bres[J].The Histochemical Journal,2002,36(6):331-337.