百草枯中毒致大鼠肺纤维化模型中肺组织的IL-17A表达

邵 敏，刘 宝，王锦权，陶晓根，潘爱军，周树生

（安徽省立医院ICU，安徽 合肥 230001）

百草枯（Paraquat，PQ）作为除草剂效果好，成本低廉。因而，在我国使用广泛。然而PQ使用时中毒病例以及口服自杀者屡见不鲜，因为没有特效的解毒剂，现已成为人类急性中毒病死率最高的除草剂。PQ中毒在早期引起多器官功能损害。晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。PQ引起的肺纤维化发病最快、最典型，而其具体的机制还不明了。以往普遍的观点认为：肺纤维化过程可能是和促纤维化的Th2型T淋巴细胞反应过强， 抗纤维化的Th1型T淋巴细胞反应不足，Th1/Th2失衡有关。近来发现了一个新的CD4+效应T细胞亚群 Th17细胞(以产生大量IL-17A为特征)。Th17具有强致病潜能，通过表达相应的细胞因子（IL-17A、1L-17F、IL-22等致炎细胞因子），刺激成纤维细胞分泌IL-8、IL-6、GM-CSF等炎症因子，激活NF-Κb转录活性。因而，IL-17A被认为极有可能是纤维化形成的又一个重要节点[1]。本实验采用定量Elisa法检测大鼠血浆和肺组织匀浆中IL-17A的表达，以了解IL-17A在PQ致肺纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

动物：清洁级纯系雄性SD大鼠24只（由安徽医科大学实验动物中心提供）体质量150～250 g，10周龄左右。试剂：20%PQ溶液购买自安徽省瑞丰化肥贸易有限公司。

1.2 动物分组、模型建立与标本处理

通过1次性灌胃给予SD大鼠1、10、20、50 mg/kgPQ进行预实验研究，并观察模型组大鼠肺组织纤维化程度。结果显示，20 mg/kgPQ1次性灌胃染毒，7 d后开始出现肺纤维化，14 d大鼠肺组织病理示纤维化达高峰期。

雄性SD大鼠24只随机分为模型组16只和对照组8只。模型组：给予PQ20 mg/kg1次性灌胃染毒；对照组予以等量生理盐水灌胃。模型组分别于给药后7 d和14 d各取8只大鼠，充分麻醉后打开腹腔，从腹主动脉采集动脉血2 mL，注入含EDTA二钠的抗凝试管中并混匀，在4℃下以3000 r/min离心10 min，分离血浆置于-70℃冰箱保存，待测IL-17A含量。放血活杀大鼠，打开胸腔，取右肺组织, 以10%福尔马林固定，酒精干燥，石蜡包埋，组织切片，苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色，进行病理学检查；另取肺组织尽快放入0.2 moL/L冰醋酸，然后在100℃水浴中煮沸10 min，匀浆，并在4℃下以3000 r/min,离心15 min，取上清液置于-70℃冰箱，供测定IL-17A含量。

1.3 肺泡炎、肺纤维化程度判断

根据Szapiel等[2]报道的评分方法判定肺泡炎和肺纤维化的程度。

1.4 血浆和肺组织匀浆IL-17A的测定

测定方法按IL-17A测试盒说明书进行。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，计量资料以“±s”表示，采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学观察

对照组HE染色可见到结构完整的肺组织，镜下肺泡形态清晰，炎性细胞无浸润；Masson染色可见少量蓝染的胶原纤维沉积在支气管周围及肺泡间隔区。染毒7 d后病理切片示明显的肺泡炎性改变，HE染色下可见水肿增厚的肺泡间隔，肺泡结构破坏伴有水肿和轻度出血，并可见炎性细胞大量浸润在肺泡腔及间质内；Masson染色显示小灶性胶原形成。14 d肺泡炎较前明显减轻，炎性细胞减少，病变范围弥散，肺泡结构大量萎陷、破坏, 新生的毛细血管周围有大量胶原沉积, 胶原和纤维蛋白占据在肺泡间隔以及部分肺泡腔内；Masson染色可见大量胶原沉积。而模型组肺泡炎、肺纤维化程度明显高于对照组，比较差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

表1 肺泡炎和肺纤维化程度分级积分（±s，n=8）

表1 肺泡炎和肺纤维化程度分级积分（±s，n=8）

注：与对照组比较*P＜0.05；与中毒后7 d比较△P＜0.05。

组别 肺泡炎 肺纤维化7 d 14 d 7 d 14 d对照组 0 0 0 0模型组 2.14±0.33* 1.57±0.11*△ 1.23±0.31* 2.16±0.56*△

2.2 肺组织匀浆和血浆IL-17A含量变化

模型组大鼠中毒后肺组织匀浆和血浆IL-17A含量较正常组明显增加，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。并随时间的延续而增加，在14 d肺组织病理纤维化达高峰期，肺组织匀浆和血浆IL-17A也达到峰值。结果见表2。

表2 对照组与中毒组各观察时间点IL-17A的变化（±s，n=8）

表2 对照组与中毒组各观察时间点IL-17A的变化（±s，n=8）

注：与对照组比较*P＜0.05；与中毒后7 d比较△P＜0.05。

组别 IL-17A（pg/mL）匀浆 血浆对照组 20.8±8.4 16.2±6.1中毒组 7 d 80.6±24.2* 66.3±18.6*14 d 150.3±41.3*△ 141.7±33.5*△

3 讨论

PQ经胃肠道吸收入血后, 肺脏通过多胺摄取途径可特异性聚集PQ，导致肺脏PQ的浓度比血液高10～90倍[3]因此PQ中毒后肺损伤尤为严重且进展迅速[4]。患者如能度过早期的ARDS期后，肺部损伤逐渐加重，将不可逆发展为肺间质纤维化，后期多死于呼吸衰竭。

本实验采用ELLSA法检测PQ染毒后大鼠血浆和肺组织中IL 17A的表达，结果显示，PQ染毒后7 d，模型组大鼠肺组织病理切片开始出现纤维化的表现：小灶性胶原形成。染毒14 d，肺纤维化最明显，此时间点大鼠血浆和肺组织匀浆中IL-17A水平明显高于对照组和染毒7 d时的大鼠血浆和肺组织匀浆中IL-17A浓度，而IL-17A的浓度与肺纤维化的程度成正相关。因此，本实验证实IL-17A在PQ中毒引起的肺纤维化的发病机制中可能起着重要的作用。

[1]Boniface K,Blom B,Liu YJ,et al.de Waal Malefyt R.From interleukin-23 to T-helper 17 cells:human T-helper cell differentiation revisited[J].Immunol Rev,2008,22(6):132-146.

[2]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[3]Chen CM,Lua AC.Lung toxicity of paraquat in the rat[J].J Toxicol Environ Health A,2000,60(7):477-487.

[4]Dinis-Oliveira RJ,Duarte JA,Sanchez-Navarro A,et al.Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity clinical features and treatment[J].Crit Rev Toxicol,2008,38(1):13-71.