还少丹对D-半乳糖致衰小鼠的抗衰老作用

程莉娟，刘群良，谭 峰，张 波，陈伶利

（湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208）

随着年龄的增加，机体的氧化和抗氧化系统之间平衡发生变化，机体清除氧自由基的能力逐渐减弱，导致氧自由基的增加并积累，造成氧化应激。过剩的自由基作用于细胞膜、线粒体、核酸、蛋白质和酶类，导致不可逆损伤，从而引起衰老、退行性疾病和肿瘤等的发生[1]。祖国医学认为，衰老与肾虚密切相关，还少丹是中医古籍中记载的补肾抗衰名方，该方具有益精补髓，壮元阳，却病延年，发白返黑的功效。本研究采用D-半乳糖诱导致衰模型小鼠，观察还少丹对小鼠脑、肝脏组织SOD、GSH-Px活性以及肝脏、脾脏指数的影响，以进一步阐明该方延缓衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级昆明种小鼠40只，雌性，7月龄，体质量（47.4±4.3）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 药物 还少丹源于《济阳纲目》，主要由中药何首乌、熟地黄、肉苁蓉、补骨脂、菟丝子、人参、山药等组成，购自湖南省药材公司；还少丹水煎剂的制备：取还少丹复方中药310 g加水800 mL，煎煮l h，过滤离心，取滤渣及沉淀加水煎煮l h后再过滤离心，合并两次滤液，加热浓缩至浓度为l g／mL（生药），置冰箱4℃冷藏保存备用。

1.1.3 试剂 D-半乳糖购自美国Amresco公司；SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器 TGL-16高速冷冻离心机购自湖南仪器厂；756型分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；BP121S电子天平购自德国Sartorius公司；电热恒温水浴箱购自北京东霞科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与药物干预 将40只雌性小鼠按体质量随机分为4组：空白对照组、衰老模型组、还少丹低剂量组、还少丹高剂量组，每组10只。在无菌条件下，将D-gal用生理盐水配制成10 g/L的溶液，以100 mg/kg·d的剂量给衰老模型组、还少丹低剂量组和还少丹高剂量组小鼠颈部皮下注射6周，建立衰老模型；空白对照组颈部皮下注射等量生理盐水。同时，用还少丹水煎剂给还少丹低剂量组和高剂量组小鼠灌胃。小鼠用药剂量按70 kg成人与20 g小鼠体表面积比值换算。低剂量组用还少丹水煎剂10 g/kg体质量灌胃（相当于成人剂量的等效剂量），高剂量组用还少丹水煎剂20 g/kg体质量灌胃（相当于成人剂量的2倍）。空白对照组和衰老模型组给予等量的蒸馏水灌胃。每周灌胃5 d，连续给药6周。

1.2.2 肝、脾指数的测定与组织匀浆的制备 给药6周后，小鼠称重，断头处死，迅速取出小鼠脑、肝脏与脾脏，用预冷的生理盐水漂洗两次，滤纸拭干称重，记录肝、脾的质量分别除以体质量再乘100%，即得肝脏指数和脾脏指数。同时，迅速将小鼠的脑与肝脏剪碎，加入9倍体积生理盐水于玻璃匀浆器中研碎，离心，所获上清液即为组织匀浆。用Comas亮蓝蛋白定量法测定组织蛋白含量。

1.2.3 SOD活性测定 依照试剂盒说明书操作，取2%脑组织匀浆和1%肝组织匀浆各50 μL，分别测定其SOD活力，结果以550 nm波长下的吸光度值计算酶活性。其活性单位定义为：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所需的SOD量为1个SOD活力单位（U）。

1.2.4 GSH-Px活性测定 参考邓修惠等[2]的方法，取2%脑组织匀浆和0.2%肝组织匀浆各400 μL于测定管中，同时加入1 mM GSH 400 μL（用pH7.0，0.2 M磷酸盐缓冲液配制）；对照管中加入等体积的1 mM GSH和0.2 M磷酸盐缓冲液；空白管加入等体积的蒸馏水与磷酸盐缓冲液。各管置37℃水浴，加入已预温的1.25 mM H2O2，混匀，反应5 min后，加入三氯乙酸终止反应，离心，取上清液加入DTNB显色液显色，于422 nm波长下测定各管吸光度值计算酶活性。其活性单位定义为：每小时每毫克组织蛋白37℃催化1 μmoL GSH氧化的酶量为一个酶活性单位。

1.3 统计学分析

所有实验数据用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，结果采用“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 还少丹对衰老模型小鼠肝脏和脾脏指数的影响

与模型组比较，空白对照组小鼠肝脏指数、脾脏指数明显高于衰老模型组，比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；还少丹低、高剂量组均能提高衰老模型小鼠的肝脏指数和脾脏指数。高、低剂量组间肝脏指数和脾脏指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 还少丹对衰老模型小鼠肝脏、脾脏指数的影响（±s，n=10）

表1 还少丹对衰老模型小鼠肝脏、脾脏指数的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较* P＜0.05，**P＜0.01。

组别 药物剂量（mg/g）肝脏指数 脾脏指数模型组空白对照组还少丹低剂量组还少丹高剂量组20——1 0 3.31±0.43 5.73±0.51**3.87±0.41*3.84±0.47*0.51±0.24 0.96±0.32**0.73±0.16*0.72±0.14*

2.2 还少丹对衰老模型小鼠脑和肝脏组织SOD活性的影响

与模型组比较，空白对照组小鼠脑、肝脏组织SOD活性均明显高于衰老模型组，比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；还少丹低、高剂量组均能明显升高衰老模型小鼠的脑组织SOD活性，但低、高剂量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；还少丹低、高剂量组能显著升高衰老模型小鼠的肝脏组织SOD活性，低、高剂量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），即随着剂量的增加，对肝脏SOD活性的影响也增强。结果见表2。

表2 还少丹对衰老模型小鼠脑、肝脏组织SOD活性的影响（±s，n=10）

表2 还少丹对衰老模型小鼠脑、肝脏组织SOD活性的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与还少丹低剂量组比较△P＜0.05。

组别 药物剂量（mg/g）脑SOD（U/mgprot）肝脏T-SOD（U/mgprot）16.00±4.25 26.05±3.90**21.86±2.82**27.60±4.57**△模型组空白对照组还少丹低剂量组还少丹高剂量组——1 0 20 47.22±3.50 71.20±8.33**47.50±6.42*53.18±5.12*

2.3 还少丹对衰老模型小鼠脑和肝脏组织GSH-Px活性的影响

与模型组比较，空白对照组小鼠脑、肝脏组织GSH-Px活性均明显高于衰老模型组，比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；还少丹低、高剂量组均能明显升高衰老模型小鼠脑、肝脏组织的GSH-Px活性；低、高剂量组间在脑组织的GSH-Px活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），但在肝脏组织中低剂量组的GSH-Px活性明显高于高剂量组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。

表3 还少丹对小鼠脑、肝脏组织GSH-Px活性的影响（±s，n=10）

表3 还少丹对小鼠脑、肝脏组织GSH-Px活性的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与还少丹低剂量组比较△P＜0.05。

866.57±47.96 718.42±53.25**861.05±43.79*785.44±61.60*△模型组空白对照组还少丹低剂量组还少丹高剂量组——1 0 20 80.92±13.03 129.02±8.66**92.93±2.61*92.12±2.68*

3 讨论

GSH-Px和SOD是体内重要的抗氧化酶，可对抗氧化压力和自由基损伤。SOD活性可间接反映机体清除自由基的能力，反映机体衰老的状况。脾脏含有丰富的免疫细胞，主要参与体液免疫，使用免疫增强剂抑制脾脏的萎缩也是延缓衰老的方法之一。另外，肝脏是机体物质代谢重要的“化工厂”[3]，故本试验也选取肝脏指数作为机体新陈代谢和免疫能力的检验指标。

本实验药方还少丹由熟地、肉苁蓉、何首乌等中药组成。近年来的研究证实，还少丹具有提高衰老模型小鼠心肌线粒体功能，降低线粒体DNA缺失的氧化损伤的作用[4-5]。本实验结果则进一步表明，还少丹还能够明显增强衰老模型小鼠脑、肝脏组织抗氧化酶GSH-Px和SOD 活性，通过清除衰老模型小鼠体内的自由基来实现延缓衰老的进程。同时，还少丹还能有效提高衰老模型小鼠的肝脏指数和脾脏指数，从而提示该方能有效地增强衰老小鼠免疫功能。因此，本实验结果结合以往的实验研究表明，还少丹可通过多种机制来达到延缓衰老的作用。

[1]Reiter RJ,Paredes SD,Korkmaz A,et al.Melatonin in relation to the“strong”and“weak”versions of the free radical theory of aging[J].Adv Med Sci,2008,53(2):119-129.

[2]邓修惠,黄学梅,李伟道,等.改良DTNB比色法测定血清GSH-Px活力[J].重庆医学,2000,29(5):445.

[3]郭红梅,成月明,潘翠燕,等.恒定磁场对小鼠免疫功能的影响[J].生物磁学,2005,5(4):18-19.

[4]程莉娟,刘群良,谭 峰,等.还少丹对D-半乳糖致衰小鼠心肌线粒体结构与功能的影响[J].国际病理科学与临床杂志,2011,31(2):93-97.

[5]程莉娟,刘群良,谭 峰,等.还少丹对D-半乳糖衰老模型小鼠心肌线粒体DNA缺失的影响[J].湖南中医药大学学报,2011,31(5):20-22.