调衡方对Lewis肺癌细胞凋亡标志物bax及bcl-2表达的影响※

张宏方 周雪宁 吴 芳 肖迎聪 环 诚 张怡敏 张程斐 刘启玲

(陕西中医学院分子病理学研究室，陕西 咸阳 712046)

1 广西中医药大学2010级本科生，广西 南宁 530001

许多肿瘤的分化、生长失控与其细胞内凋亡相关因子密切相关，尤其是肺癌对人类的健康危害显得更为严重。研究表明肿瘤细胞无限增殖失控主要是其抑制凋亡的bcl-2基因及促进凋亡的bax基因失调而导致［1］。我们以前的研究表明，调衡方有较明显的抗肿瘤转移的作用，且可明显减少转移灶的数量和大小［2-4］。调衡方抗肿瘤转移是否与 bax、bcl-2凋亡相关基因有关，仍未揭示清楚［2-4］。本研究以Lewis肺癌细胞内bax、bcl-2为对象，探讨调衡方含药血清对Lewis肺癌细胞内bax及bcl-2的影响，从而揭示调衡方对Lewis肺癌细胞凋亡的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 溴化四唑蓝(MTT)为Sigma公司产品;Trizol为美国 Amresco公司产品;bax、bcl-2、β-actin的PCR引物均由北京三博远志生物技术有限公司合成，总RNA提取试剂盒(RNAfast200)购自上海飞捷生物科技有限公司。cDNA第一条链合成试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)、实时定量试剂盒(SYBR Green-ROX qPCR Master Mix)均购自Fermentas(立陶宛)。二甲亚砜(DMSO)、胰酶(1∶250)(美国 Sigma 公司);RPMI-1640(Gibico)和胎牛血清(美国Hyclone公司)。细胞周期DNA含量检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.1.2 仪器 全自动酶标仪(美国 Bio-Tek ELX808IU);实时定量PCR仪(美国 Bio-Rad IQ5.0);全自动高压灭菌器(日本三洋MLS-3780);倒置显微镜(奥特BDS-200);流式细胞仪(美国 Beckman CELL LAB QUANTA SC);CO2培养箱(美国Napco公司);超低温冰箱(美国热电702型)。

1.1.3 实验动物 无特定病原体(SPF)雌性SD大鼠32只，二级，体质量(200±20)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(陕)2007-001，置本室二级动物实验室饲养。

1.1.4 细胞株 Lewis肺癌株购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.5 药品 调衡方是由生黄芪、生山药、白花舌蛇草、西洋参、天花粉、莪术、生鸡内金、天门冬、水蛭等组成，诸药均经过生药学鉴定，符合《中华人民共和国药典》(95年版)规定质量标准。将上述药物经煎药浓缩制取(每1 mL含生药3 g)，分装灭菌备用。AG490购自美国 Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清的制备 将SD大鼠32只随机分为调衡方大、中、小剂量含药血清组及正常血清组(各组给药剂量相当于临床等效剂量，依据文献［5-7］方法计算人鼠等效剂量及制备含药血清)，每组各8只，给药剂量分别为32、18、9 g/kg及灌服等容积的0.9%氯化钠注射液，分2次给予，连续给药5 d，末次灌胃后禁食12 h，但不禁水，再给1 d的量，1 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏内采血，血液静置后2 500 r/min离心后取血清，56℃水浴30 min灭活，用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌(在超净工作台上)，分装于1.5 mL EP 管，-70 ℃冰箱保存备用［8］。

1.2.2 MTT法检测调衡方对Lewis肺癌细胞生长的抑制作用 将Lewis肺癌细胞用0.25%胰蛋白酶消化，传代至96孔板中，共5组，即调衡方含药血清大、中、小剂量组、调衡方中剂量含药血清+AG490溶液(25 μmol/L)组及正常血清组，每组设6个复孔，每孔接种1×104～2×104个Lewis肺癌细胞100 μL，另加100 μL核酸内切酶A(培养基，在37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h。待细胞会合率达80% 时，分别加入不同浓度调衡方含药血清10 μL及调衡方中剂量含药血清+AG490溶液(25 μmol/L)，各孔加培养液至200 μL，还设只加培养液200 μL的空白孔与只加Lewis肺癌细胞悬液200 μL的对照孔(各种浓度均为6平行孔)。分别在24、48、72 h时取出1板，每孔再加5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h。弃各孔内液体，每孔加入 DMSO 100 μL，振荡 10 min，以 490 nm 为测定波长，630 nm为参比波长在全自动酶标检测仪上测各孔吸光度值(OD值)。根据细胞生长抑制率公式：生长抑制率=(对照组 OD值 -用药组 OD值)/对照组 OD值 ×100%，计算抑制率［9］。重复此实验3次。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期与凋亡状况 取对数生长期Lewis肺癌细胞，将培养液换成不同浓度的调衡方含药血清溶液，继续培养24 h。取不同浓度的调衡方含药血清液24 h干预的Lewis肺癌细胞，同时设立阴性对照组，并用胰酶消化各组贴壁的Lewis肺癌细胞，且各组细胞收集好，在1 500 r/min离心5 min的条件下，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤Lewis肺癌细胞1次，调整Lewis肺癌细胞为1×106/mL的浓度。各组细胞液用70%乙醇固定且4℃存放，染色前用PBS洗去固定液，加100 μL核酸内切酶(RNase A)，37℃水浴中置30 min。再加 PI 400 μL混匀染色且于4℃避光30 min后上机检测(记录激发波长488 nm处红色荧光)。各组样品行DNA单参数含量分析(获得2.0×104个细胞样品)其 DNA含量。用软件CellquestTM获取数据，用软件ModfitLT作图并分析数据，测量凋亡的标准用定量亚二倍体峰。

1.2.4 RT-PCR 检测 bcl-2、bax mRNA 的表达

1.2.4.1 提取总RNA(用 RNAfast 200) 将不同浓度的调衡方含药血清24 h干预的Lewis肺癌细胞收集好，在培养皿中用1 mL裂解液裂解细胞后移至EP中，置室温5 min且加氯仿200 μL混匀后，再置室温5 min且4℃离心(12 000 g离心15 min)，转移上层约400 μL水相放置于纯化柱的内套管中，12 000 g离心1 min，弃去外套管中液体，加500 μL 75%的乙醇(DEPC：焦碳酸二酯处理并高温灭菌的H2O配制)于内套管中，12 000 g离心1 min，再次离心1 min，弃去外套管，换1个干净的EP管套在内套管上，在内套管的膜中央加洗脱提取液30 μL，在4℃放置5 min后，13 500 g离心1 min收集提取的总RNA。

1.2.4.2 两步法实时 PCR逆转录反应 在0.2 mL PCR管中，加入总RNA 1 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达 11 μL。再加 10 μM Oligo(dT)12-18 1 μL，轻轻混匀、离心。65℃加变性5 min，立即将PCR管插入冰浴中冷却2 min。然后依次加入下列成分：5 ×PCR buffer 4 μL，RNA酶抑制剂 1 μL，10 mM dNTPmix 2 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，混匀瞬时离心，25 ℃，5 min，44 ℃，60 min，于70℃加热5 min以终止反应，cDNA-20℃短期保存或者-70℃长期保存备用。第2步PCR反应：bcl-2 上游引物：5'-CGGGAGAACAGGGTATGATAAC-3'，下游5'-GGCTGGAAGGAGAAGATGC-3'，扩增产物大小为147 bp。bax上游引物：5'-TGCTACAGGGTTTCATCC-3'，下游 5'-CCAGTTCATCTCCAATTCG-3'，扩增产物大小为135 bp。actin上游引物序列：5'-ACCACACCTTCTACAATGAG-3'，下游 5'-ACGACCAGAGGCATACAG-3'，扩增产物大小为182 bp。25 μL的总体积(加入2 ×Syber Green预混Taq酶12.5 μL，加上下游引物至终浓度0.2 μmol/L，加入第 1 步反应得到的 cDNA 模板 1 μL，以DEPC H2O补足至25 μL，混匀)。每个样品做2组副孔，实时上机检测。扩增条件：第1步，50℃ 2 min;第2步，95 ℃ 10 min; 第3 步，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，收集荧光信号，在该阶段扩增40个循环;第4步，做溶解曲线。经绘制标准曲线验证，各个产物的扩增效率以目标基因与β-actin扩增产物的双Delta-CT比值分析计算各个组的表达情况。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS 11.0统计软件分析处理实验数据，计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用t检验。

2 结果

2.1 抑制Lewis肺癌细胞生长的增殖作用 不同剂量调衡方含药血清干预的Lewis肺癌细胞24、48、72 h后，对Lewis肺癌细胞的增殖均有抑制作用，且随着调衡方含药血清药物剂量的增加，Lewis肺癌细胞增殖抑制率亦增大(呈现出时间及浓度的依赖性)。提示调衡方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖有抑制作用。见图1。

2.2 调衡方对Lewis肺癌细胞周期与凋亡的影响 见表1。

表1 调衡方对Lewis肺癌细胞周期与凋亡的影响%，±s

表1 调衡方对Lewis肺癌细胞周期与凋亡的影响%，±s

与正常血清组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

组 别 药物浓度(g/kg) G0期/G1期 G2期/M期 S期 凋亡率正常血清组48.86 ±1.77 9.82 ±0.91 39.32 ±2.27 1.23 ±0.21小剂量血清组 9 53.30 ±1.75 9.85 ±1.25 36.85 ±2.47 2.57 ±0.68中剂量血清组 18 55.31 ±0.96* 12.13 ±1.15 32.56 ±2.46* 8.97 ±1.27＊＊大剂量血清组 32 55.64 ±0.44＊＊ 12.96 ±1.52 31.40 ±0.93* 9.63 ±1.00＊＊中剂量血清 +AG490组 (18+25) μmol/L 59.36±0.41＊＊ 13.16±1.56 27.48±1.04＊＊ 10.10±0.63-＊＊

由表1可见，不同浓度的调衡方含药血清干预Lewis肺癌细胞24 h后，其细胞凋亡率随调衡方含药血清药物浓度的递增而增加，且除小剂血清组外，调衡方含药血清干预组与正常血清组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，尤其是中剂量含药血清+AG490组作用非常显著;而调衡方含药血清对Lewis肺癌细胞周期的影响亦是随调衡方含药血清药物浓度的增加，肺癌细胞S期减少或被阻滞(P＜0.05，P ＜0.01)，G0/G1 期有所延长(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 调衡方对Lewis肺癌细胞凋亡相关基因bcl-2、bax mRNA的影响 见表2。

表2 调衡方对Lewis肺癌细胞凋亡调控基因bcl-2及bax mRNA的影响 ±s

表2 调衡方对Lewis肺癌细胞凋亡调控基因bcl-2及bax mRNA的影响 ±s

与正常血清组比较，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

组 别 药物浓度(g/kg) bcl-2/β-actin bax/β-actin bax/bcl-2正常血清组0.979 ±0.036 0.778 ±0.030 1.259 ±0.014小剂量血清组 9 0.972 ±0.004 0.916 ±0.064 1.066 ±0.086*中剂量血清组 18 0.792 ±0.038* 0.97 ±0.042* 0.816 ±0.007＊＊大剂量血清组 32 0.705±0.034＊＊ 0.985±0.030＊＊ 0.715±0.016＊＊中剂量血清 +AG490组 (18+25)μmol/L 0.662±0.039＊＊ 0.988±0.001＊＊ 0.672±0.048-＊＊

由表2可见，不同浓度的调衡方含药血清干预Lewis肺癌细胞24 h后，bcl-2 mRNA的表达量随着药物浓度递加均有明显下降，而bax mRNA的表达量呈上升趋势，除小剂量血清组外，其余各组与正常血清组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。尤其是中剂量血清 +AG490组bcl-2 mRNA表达降低、bax mRNA表达上升更为显著(P＜0.01)，说明调衡方与细胞信号转导特异性抑制剂AG490联合有相加作用。

3 讨论

临床研究发现，中药复方制剂是中医治疗肿瘤的重要手段，许多中药及其复方能提高机体免疫功能，增强放化疗效果和减轻放化疗的不良反应［2，10］，甚至某些中药可直接抑制和杀伤肿瘤细胞，因而中药及其复方抗肿瘤具有独特优势。bcl-2、bax是细胞内一对与凋亡密切相关的基因，bcl-2为抑制凋亡的基因，而bax为凋亡促进基因。bcl-2激活后通过细胞内一系列的天冬氨酸特异性的半胱氨酸酶的活化直接或间接抑制细胞的凋亡［11］。胞内的bax蛋白表达增加而促使细胞凋亡。若在细胞内的bax/bcl-2比值增加，使细胞内的线粒体发生一系列变化，最终导致Caspase级联反应［8，12-13］，而促使细胞凋亡。本实验用调衡方含药血清干预Lewis肺癌细胞，发现调衡方含药血清可促进肺癌细胞中bcl-2基因下调，bax mRNA表达提升，提示调衡方含药血清可能通过提升bax/bcl-2比值而诱导肺癌细胞的凋亡。

通过调衡方含药血清干预Lewis肺癌细胞，用RTPCR法测定肺癌细胞相关基因的变化表达，结果显示，用药后bcl-2可明显下调，bax基因表达水平显著上调。另外，通过调衡方含药血清干预的Lewis肺癌细胞，其细胞周期时相分布改变(S期的比例随着调衡方药物剂量的增加而减少，G0/G1期比例而增加)，所以肺癌细胞增殖减慢。提示调衡方含药血清对Lewis肺癌细胞凋亡的诱导部分机制可能与降低bcl-2表达及上调bax的表达有关，即通过升高bax/bcl-2比值，促进Lewis肺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。

［1］Cory S，Adams J M.The bcl-2 family：regulators of the cellular life or death switch ［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(9)：647-656.

［2］张宏方，白志超，任丽红，等，调衡方对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能调节的实验研究［J］.第四军医大学学报，2009，30(18)：1689-1692.

［3］张宏方，张奇，任丽红，等，调衡方抗荷瘤小鼠Lewis肺癌癌转移的实验研究［J］.南开大学学报：自然科学版，2009，42(5)：108-112.

［4］张宏方，环诚，白志超，等，调衡方对S180荷瘤小鼠腹水癌细胞的作用及免疫功能的影响［J］.河北中医，2010，32(8)：1230-1232.

［5］陈奇.中药药理实验［M］.贵阳：贵州人民出版社，1998：230.

［6］李仪奎.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：562.

［7］韩锐.抗癌药物研究与实验技术［M］.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：284.

［8］袁易，王旭慧.消瘤1号通过影响bax和bcl-2的表达诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡［J］.药学服务与研究，2010，10(4)：267-270.

［9］靳福鹏，张梅，李平，等.益气养阴解毒方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡影响的体外实验［J］.肿瘤防治研究，2011，38(8)：867.

［10］方乐堃，潘凌霄，黎雅婷，等.复方小柴胡汤对荷EAC鼠IL-2水平和CD4+/CD8+比值的影响［J］.中国病理生理杂志，2007，23(9)：1720-1723.

［11］杨景，柳凤轩，阎晓初.凋亡抑制因子存活素的研究进展［J］.癌症，2003，22(7)：771-774.

［12］Cory S，Adams J M.The bcl-2 family：regulators of the cellular life or death switch ［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(9)：647-656.

［13］袁易，王旭慧.消瘤1号诱导MCF-7人乳腺癌细胞凋亡的研究［J］.中国药房，2010，21(35)：3278-3279.