Cx36在癫持续状态大鼠海马神经元的表达

戴珍祥 高志伟

1）南京市六合区人民医院神经内科 南京 211500 2）南通大学附属医院神经内科 南通 226000

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物与分组：健康雄性SD大鼠由南通大学实验动物中心提供，共36只，6～8周龄，体质量（250±20）g，随机分为生理盐水组、喹啉组、辛醇组，每组12只大鼠。

1.1.2 试剂与仪器：氯化锂、匹罗卡品、喹啉、辛醇（美国Sigma公司）；兔抗大鼠Cx36多克隆抗体、荧光标记Cx36抗体（北京博奥生生物技术公司）；二抗（碧云天生物技术公司）；冰冻切片机，正置显微镜（德国Leica公司）；电泳仪（美国Bio－Rad公司）。

1.2方法

1.2.1 动物模型制备与处理：氯化锂－匹罗卡品诱导的癫大鼠模型是参照Glien［4］提出的方法，稍作改良后建立的。将大鼠适应性饲养3d，观察大鼠饮食活动正常后称重，将大鼠腹腔注射氯化锂125mg／kg预处理，间隔18～24h后给予匹罗卡品60mg／kg腹腔注射，30min后观察大鼠癫发作程度，达到Racine评分4级及以上的大鼠进入癫持续状态（SE）。模型制备成功30min后分别予以各组大鼠腹腔注射喹啉（60mg／kg）、辛醇（60mg／kg）及等量生理盐水。

1.2.2 Racine评分：根据 Racine［5］制定的标准判断是否有癫发作行为：0级（0分），无任何癫发作；1级（1分），嘴及面部阵挛，咀嚼，哈欠；2级（2分），1级基础上出现点头，面部抽搐，颈部肌肉抽动；3级（3分），2级基础上出现前肢或后肢抽搐；4级（4分），3级基础上出现后肢站立，身体突然立起；5级（5分），4级基础上出现四肢节律性抽动，下肢强直伴全身背曲或抽动，跌倒。分别对各组癫持续状态大鼠模型及给药后30min、1h、2h及3h时进行Racine评分。

1.2.3 Cx36表达检测：各组大鼠分别于给药后2h进行海马Cx36表达检测。（1）免疫荧光方法：用3.5%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉，开胸暴露心脏，左心室插管，剪开右心耳，先快速灌入温生理盐水100mL至血液冲净，随后灌入4%多聚甲醛500mL固定。灌注固定后开颅取脑，4%甲醛浸泡，蔗糖梯度脱水，冰冻切片机切片，山羊血清封闭过夜，0.1%PBS洗涤后予以4℃条件下孵育荧光标记抗体过夜，再次洗涤后贴脑片、甘油封片，然后在荧光显微镜下观察海马Cx36的变化。（2）Western－blot方法：将大鼠急性断头，在冰上取出脑组织，秤取100mg海马组织在1000μL蛋白裂解液加10μL蛋白酶抑制剂中匀浆，充分混匀后高速离心沉淀，取上清液，通过BCA法测出蛋白浓度。按每上样孔60 μg蛋白上样量计算出上样容积，上样至已制备好的10%分离胶板上样孔里，以恒压110V1.5h及恒流350mA 2h分别进行电泳及转膜，然后牛奶封闭2h、一抗4℃孵育过夜、二抗室温2h孵育、Ecl发光、暗房显影定影，应用数字凝胶成像系统拍照，计算目的条带与内参条带灰度值比值，表示相对含量。

1.3统计学方法采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理。数据结果以均数±标准差（s）表示，用药前后行为学评分差异应用配对t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，组间两两比较用q检验。

2 结果

2.1各组大鼠Racine评分比较见表1，生理盐水组大鼠给药前后Racine评分差异无统计学意义（P＞0.05）。喹啉组及辛醇组大鼠给药前后Racine评分差异有统计学意义（均P＜0.01）。与生理盐水组比较，给药后喹啉组及辛醇组Racine评分差异有统计学意义（均P＜0.01）。

表1 各组大鼠Racine评分比较 （s，分）

表1 各组大鼠Racine评分比较 （s，分）

注：与给药前比较，＊P＜0.01；与生理盐水组比较，△P＜0.01

组别 n 给药前30min 给药后30min 给药后1h 给药后2h 给药后3h生理盐水组 12 4.21±0.18 4.63±0.18 4.75±0.16 4.50±0.19 4.25±0.16喹啉组 12 4.32±0.25 1.13±0.14﹡△ 2.00±0.27﹡△ 0.88±0.12﹡△ 0.75±0.15﹡△辛醇组 12 4.29±0.27 1.25±0.23﹡△ 2.13±0.35﹡△ 1.00±0.15﹡△ 0.88±0.23﹡△

2.2各组大鼠海马组织Cx36表达比较见表2。

2.2.1 应用免疫荧光法检测大鼠海马Cx36阳性细胞的表达：通过免疫荧光观察发现各组均有Cx36阳性细胞的表达，生理盐水组Cx36阳性细胞数明显高于喹啉组及辛醇组，差异有统计学意义（P＜0.01）；而后2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、图2、图3。

图1 生理盐水组海马神经元C×36表达 A 10×10、B 10×20、C 10×40

图2 喹啉组海马神经元C×36表达 D 10×10、E 10×20、F 10×40

图3 辛醇组海马神经元C×36表达 G10×10、H10×20、I10×40

2.2.2 应用 Western－blot方法检测大鼠海马Cx36含量的变化：见图4。通过 Western－blot方法检测发现各组均有Cx36蛋白，生理盐水组明显高于喹啉组及辛醇组，差异有统计学意义（P＜0.01）；而后2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠海马神经元C×36表达变化 a：生理盐水组，b：喹啉组，c：辛醇组

表2 各组大鼠海马神经元Cx36表达比较（s）

表2 各组大鼠海马神经元Cx36表达比较（s）

注：与生理盐水组比较，＊P＜0.01

组别 n 阳性细胞数（个／mm2）灰度比生理盐水组12 82.53±0.32 0.56±0.003喹啉组 12 27.34±0.18﹡ 0.21±0.004﹡辛醇组 12 26.24±0.29﹡ 0.24±0.005﹡

与生理盐水组比较，喹啉组及辛醇组大鼠海马Cx36表达水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；而后2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

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