1株喹啉降解菌的筛选及其降解特性

2018-09-10邓冬梅梁秀芬万美玲吴桂珍陈业祖孙宇飞

江苏农业科学 2018年15期

邓冬梅，梁秀芬，李晴，何勍，万美玲，吴桂珍，韦烽，陈业祖，孙宇飞

(广西科技大学生物与化学工程学院/广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州 545006)

喹啉是一类降解性能很差的复杂有机物，是很多杀虫剂的主要成分，会导致土壤农药残留污染[1]。作为一种典型的氮杂环芳烃化合物，喹啉具有较大的毒性和间接的致突变性[2]，对环境有很大的潜在危害，应使污染土壤中的喹啉进行有效降解。目前喹啉的降解有物理、化学和生物方法，其中生物降解喹啉具有成本低、对环境无二次污染、易于操作等优点，是目前研究喹啉降解的热点[3]。自从从土壤中分离出能降解喹啉的莫拉氏菌(Moraxellasp.)[4]及假单胞菌(Pseudomonassp.)[5]菌株后，目前已有多种喹啉降解菌被分离，如红球菌(Rhodococcussp.)[6]、假伯克霍尔德菌(Burkholderiapickettii)[7]、丛毛单胞菌属(Comamonassp.)[8]、脱硫微菌(Desulfobacteriumindolicum)[9]、白腐真菌[10]等。

为达到稳定高效的去除效果，菌株间的复配已成为共识，为此需要更多高效喹啉降解菌提供复配菌源。此外，环境因素也是实际处理工程中影响去除效果的主要因素。因此本研究希望通过筛选喹啉降解菌，并考察环境因素对降解菌的影响，以期为生物固定化等方法去除环境中的喹啉提供菌源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株菌株筛选自柳钢焦化废水A/O生物处理系统的O池中活性污泥。

1.1.2 培养基细菌富集培养使用LB培养基，包含10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L NaCl，pH值为7.2～7.6。细菌分离和降解试验中，培养基为无机盐培养基(mineral salt medium，MSM)[11]，包含4.26 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.02 g/L CaC12、0.05 mg/L KI、2 mg/L MnSO4·4H2O、0.2 mg/L CuSO4·2H2O、2 mg/L ZnSO4·7H2O、2.5 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.082 mg/L H3BO3、1 mg/L FeC13·6H2O，喹啉(根据需要加入)，pH值为7.2～7.6。固体培养基为在液体培养基中投加15 g/L琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的驯化和分离取5 mL活性污泥，至LB培养基中富集培养，培养24 h后依次转移到含喹啉50、100、200、300、400、500 mg/L的MSM培养基中，30 ℃、120 r/min各驯化培养6 d。驯化后菌液经在LB培养基上涂布稀释分离及平板划线纯化后得到纯菌株，编号为L-F。将L-F菌接种于LB培养基中富集培养，富集的纯菌保存在15%的甘油中，存于-60 ℃冰箱中待用。

1.2.2 16S rRNA鉴定利用细菌鉴定的通用引物27F和1492R[12]对菌液进行PCR片段基因扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系(50 μL)包括25 μL DNA聚合酶mix、菌液模板4 μL、去离子水17 μL、上下游引物各 0.5 μL。PCR温度程序为：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，循环29次；最后 72 ℃ 终延伸10 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(中国康宁生命科学有限公司)对PCR产物进行纯化。将回收的DNA送往上海立菲生物技术有限公司广州分公司进行序列测定，并将序列在NCBI网页上进行Blast同源性比对。

1.2.3 菌株降解条件及降解特性研究以喹啉降解率为指标，利用单因素试验研究pH值、温度和初始苯酚浓度对菌株生长及降解喹啉的影响，根据环境单因素试验结果，用 Design-Expert软件生成3水平3因素组合条件(表1)，根据所生成的各组合条件摇床培养菌株，测定培养6 d后喹啉浓度，计算降解率，所得结果输入Design-Expert软件，生成分析。将L-F菌在响应面法所确定的最优条件下进行摇床培养，每隔2 h测定喹啉浓度和菌液浓度，绘制生长曲线和喹啉降解曲线。

表1 响应面分析因素与水平

1.2.4 分析方法菌种浓度的测定采用比浊法，使用分光光度计于波长600 nm处测定其D值[13]。喹啉含量测定采用紫外分光光度法[14]，使用分光光度计于波长313 nm处测定其D值。

2 结果与分析

2.1 喹啉降解菌筛选与鉴定

驯化过程中，培养液出现由无色→粉红色→紫红色→浅褐色的变化，与假单胞菌(Pseudomonassp.QG6)降解喹啉过程中颜色变化[15]相似，其颜色变化是降解喹啉的中间产物所致，初步说明摇瓶中的菌也具有喹啉降解特性。经平板划线分离，得到1株菌，命名为L-F菌株。L-F的16S rRNA序列与数据库GenBank中的Providenciasp.序列同源性达99%，初步鉴定L-F菌株为普罗威登斯菌(Providenciasp.)。普罗威登斯菌(Providenciasp.)中雷氏普罗威登斯菌(Provideaciarettgeri)[16]被证明有脱氮性能，而喹啉属于氮杂环类化合物，其降解与脱氮[17]有关，但该菌并未研究其喹啉降解特性，其降解喹啉的机制有待进一步研究。

2.2 L-F菌株降解条件研究

2.2.1 喹啉初始浓度对降解率的影响由图1可知，喹啉初始浓度由100 mg/L增加到900 mg/L，L-F对喹啉降解率先增大后减小，但增大或减小幅度并不是很明显，其中喹啉浓度700 mg/L时L-F的降解率最高。

2.2.2 pH值对菌株喹啉降解率的影响如图2所示，当pH值<7.5时，L-F对喹啉的降解率随pH值的增加而增大；当pH值为7.5时，喹啉降解率达最高值97%；当pH值>7.5时，降解率呈现缓慢下降趋势，但下降幅度不大，降解率依然高于90%。

2.2.3 温度对菌株喹啉降解率的影响如图3所示，温度由20 ℃增加到40 ℃时，L-F对喹啉的降解效率先增大后减小，30 ℃时，L-F对喹啉降解率最强。

2.2.4 响应面法优化菌株喹啉降解条件如表2所示，在设计的试验条件下，喹啉最大降解率达到96%，最小降解率为67%。将表2中的结果导入Design-Expert软件，固定1个环境因素的情况下，以另外2个环境因素为x和y轴，以降解率为z轴作图，得到在不同降解条件下的喹啉降解率响应曲面。如图4所示，温度和pH值对降解率的交互影响最显著，而温度和底物浓度、pH值和底物浓度对降解率的交互影响不太显著。

由图3还可知，L-F菌株降解喹啉的最优条件为：温度30 ℃，pH值7.5，底物浓度700 mg/L，在此条件下培养6 d后，对喹啉的降解效率达96%，和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)[18]等高效喹啉降解菌株的降解能力相当。

2.2.5 菌种生长曲线及降解特性由图5可知，0～15 h时L-F生长缓慢，可能是因为于喹啉抑制了菌株的生长；15～42 h之间为对数生长期。但喹啉降解速度基本稳定，喹啉浓度逐步降低，50 h时喹啉降解率已达80%，此降解规律和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)有一定差异。王培明等发现，恶臭假单胞菌(P.putida)在对数生长期喹啉降解率最高[19]。降解特性的不同可能和菌株对喹啉的降解机制有关。