多花黄精提取物对水果采后病原菌的抑菌活性研究

2012-09-28胡娇阳操海群花日茂吴祥为岳永德

植物保护 2012年6期

胡娇阳，汤锋，操海群＊，花日茂，吴祥为，王进，岳永德

（1.安徽农业大学，安徽省农产品安全重点实验室，合肥 230036；2.国际竹藤中心，北京 100080）

新鲜水果采后病害是一个全球性的问题。据报道，发达国家有10%～30%的新鲜水果损失于采后腐烂，而在发展中国家，腐烂率高达40%～50%［1］。国内外常用的水果采后病害的防治方法主要有低温法、气调法、化学杀（抑）菌剂处理等。前两种方法投资大、能耗高、且对于病害真菌的抑制作用有限，所以目前仍然以施用化学杀菌剂为主要防治手段［2］。众所周知，传统化学杀菌剂的长期使用带来了种种弊端，如植物病原菌抗药性的产生、残留毒性以及对生态环境造成的严重影响等［3］。随着人们对果品质量要求的不断提高和环保意识的增强，公众迫切需要在水果采后防腐保鲜过程中寻找新的病害防治剂。近年来，利用天然植物提取物来防治果实采后病害成为人们研究的热点［4］。杨锋波等报道了浓度为25.00mg／mL的紫茎泽兰乙醇提取物对香焦炭疽菌、柑橘炭疽菌、疫霉的抑菌率分别为58.09%、40.34%、45.63%，其石油醚萃取部分对香蕉炭疽菌的抑菌作用最好，EC50值为0.42mg／mL［5］。杨红等研究了丁香精油以及丁香精油－壳聚糖复合物对水果采后腐烂的主要致病真菌灰霉菌、链格孢、青霉菌、浆孢菌等均具有较强的抑制作用［6］。吴光旭等报道了开口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物处理荔枝果实，可明显减轻荔枝贮藏病害的发生并能延缓其主要品质性状的劣变［7］。

多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua），别名南黄精、山姜、野生姜，为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物［8］。近年来国内外的研究表明，黄精具有增强机体免疫、抗肿瘤、抗HIV、降血糖血脂和抑菌等功效［9］。郑春艳等研究了黄精多糖对大肠杆菌、副伤寒杆菌、白葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌等具有较强的抑制作用［10］。王冬梅等测定了卷叶黄精的正丁醇萃取物对苹果褐腐病菌、玉米大斑病菌和棉黄萎病病原菌的抑制作用较强，EC50分别为261.26、376.03μg／mL和430.05μg／mL［11］。余红等用气相色谱－质谱（GC－MS）联用技术分析了多花黄精精油的成分，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、红酵母均有较强的抑制能力［12］。苏伟等报道了黄精多糖对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用［13］。然而，目前有关多花黄精提取物对水果采后病原菌抑制效果方面的研究报道所见甚少。

本试验以苹果炭疽病菌、梨炭疽病菌、葡萄灰霉病菌和苹果轮纹病菌等4种水果采后病原菌为对象，采用生长速率法对多花黄精不同有机溶剂提取物进行了室内抑菌活性测定，筛选出了高活性提取物，并开展了果实上的防效验证。研究结果将为利用多花黄精抑菌活性成分开发新型水果采后病害防治剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物

多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua），安徽省九华山黄精研究所提供，采集时间为2011年4月。

1.1.2 供试植物病原菌

苹果炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.］、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengerianaf.sp.piricola Koganezawa et Sakuma）、梨炭疽病菌［Glomerella cingulata（Stonem.）Spauld.et Schrenk］、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）等4种水果采后病原菌，安徽农业大学植物保护学院植物病理学教研室提供。

1.1.3 仪器设备与试剂

旋转蒸发仪：EYELA N－1001（日本东京理化器械株式会社）；智能型光照培养箱：MGC－300A（上海一恒科技仪器有限公司）；乙酸乙酯、石油醚、丙酮、无水乙醇、甲醇等均为分析纯，江苏强胜化工有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多花黄精提取物的制备

样品预处理：将刚采集的新鲜多花黄精根，用蒸馏水冲洗干净，切成片，55～60℃烘干，用电动粉碎机粉碎，过40目筛，得多花黄精根粉末。

索氏提取器提取：准确称取20g多花黄精根粉，用滤纸包实后置于250mL索氏抽提器中，分别加入甲醇、无水乙醇、丙酮、石油醚等有机溶剂浸泡过夜后，于适宜温度（高于提取溶剂沸点10℃左右）开始提取，待提取器支管中流下的液体为无色时，即停止提取（提取时间为2～4h）。

回流提取法提取：准确称取50g多花黄精根粗粉，置于500mL的圆底烧瓶中，加入250mL石油醚浸泡过夜后，于（40±2）℃回流提取3～4h。

将不同方法提取液分别抽真空过滤后，经旋转蒸发器浓缩，得膏状粗提物，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 抑菌活性的室内毒力测定方法

采用生长速率法测定多花黄精提取物对供试菌的毒力作用。准确吸取5mL浓度为50g／L的药液加入45mL融化培养基（50℃）的三角瓶中，配制成5.0g／L的含药培养基，混合均匀后倒入灭菌的培养皿（直径9.0cm）内，冷却后即为带药培养基平板。同时做相同体积的溶剂对照。在已培养3～4d的供试菌平板上，用直径为0.6cm的打孔器制成若干菌饼，用接种针挑取菌饼轻放于含药培养基平面上（有菌丝的一面向下）。每培养皿放置2个菌饼。每处理重复3次。在（28±2）℃下培养一定时间后，检查各处理菌落的直径，按下式计算不同处理对供试菌的菌丝生长抑制率。

1.2.3 对苹果炭疽病的防效测定

1.2.3.1 保护作用

分别用浓度为50、100、150g／L的多花黄精石油醚和丙酮提取液浸泡或喷雾的方式处理果实，72h后以浓度为1×105个／mL分生孢子悬浮液针刺接种于苹果。放置在28℃光照培养箱保湿培养，7d后测量病斑直径、计算防治效果，以溶剂处理后接种炭疽菌为对照。每处理3次重复，每次重复10个苹果，每个果实接种一个点。

1.2.3.2 治疗作用

用浓度1×105个／mL的分生孢子悬浮液针刺接种于苹果，72h后分别用浓度为50、100、150g／L多花黄精石油醚和丙酮提取液采用浸泡或喷雾的方式处理接种过的果实。以1×105个／mL炭疽病菌同时接到苹果果实上作为对照。每处理10个果实，重复3次。放置在28℃光照培养箱保湿培养，逐日观察病斑的大小，7d后测量病斑直径、计算防治效果。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取物的抑菌活性

用石油醚、丙酮、乙醇、甲醇等不同极性溶剂，对多花黄精进行索氏提取，不同提取溶剂的提取率差异较大，石油醚的提取率仅为0.23%，而甲醇的提取率达到31.37%。多花黄精热水浸提的提取率为11.95%（表1）。以苹果炭疽病菌为供试菌，不同提取溶剂提取物的抑菌活性测定结果表明，在质量浓度为5.0g／L时，多花黄精石油醚提取物表现出较强的抑菌活性，72h菌丝抑制率达到73.67%；其次是丙酮提取物，菌丝抑制率达到57.67%；甲醇提取物对苹果炭疽病的抑制效果超过了50%；无水乙醇提取物的抑菌活性最小，菌丝抑制率不超过20%，几乎没有抑制作用。

表1 多花黄精不同溶剂提取物对苹果炭疽病菌的抑菌活性1）

2.2 多花黄精石油醚提取物对不同供试菌的抑菌活性

分别测定了质量浓度为5.0g／L的多花黄精石油醚提取物对4种水果采后病原菌的抑菌活性。结果表明（表2），石油醚提取物对供试病原菌表现出不同程度的抑制作用，其对苹果炭疽病菌和梨炭疽病菌的抑制效果较好，72h菌丝抑制率分别达到73.67%和62.39%；而对葡萄灰霉病菌和苹果轮纹病菌的菌丝生长抑制率均都小于25%，抑制作用不明显。

表2 多花黄精石油醚提取物对供试采后病原菌的抑菌活性1）

设置系列浓度，分别测定了多花黄精石油醚提取物和丙酮提取物对苹果炭疽病菌的抑菌活性。结果表明（表3），供试提取物的抑菌活性随浓度的增高而增强，两者呈显著的正相关性。多花黄精石油醚提取物对苹果炭疽病菌的毒力大于丙酮提取物。

表3 多花黄精提取物对苹果炭疽病菌的毒力回归方程1）

2.3 不同提取方法提取物的抑菌活性

以苹果炭疽病菌为供试菌，测定了多花黄精不同提取方法提取物的抑菌活性。结果表明（表4），应用索氏抽提法得到的多花黄精石油醚提取物的EC50值略小于回流提取的提取物。索氏提取是一种比较经典的提取方法，提取效率较高，所得到的粗提物中抑菌有效成分含量可能相对较多。

表4 多花黄精不同提取方法提取物对供试菌的毒力回归方程1）

2.4 不同年份多花黄精提取物的抑菌活性

将刚采集的多花黄精新鲜样品按生长年份分类，分别经过通风烘干、粉碎、石油醚提取后，获得不同年份多花黄精提取物。其对苹果炭疽病菌72h抑菌活性测定结果表明（表5）：3年以下多花黄精提取物的抑菌活性最低，其抑菌活性随着生长年份的延长而呈现出增强的趋势，菌丝抑制率在61.69%～76.18%之间。4～6年多花黄精的抑菌活性相近。

表5 不同年份多花黄精石油醚提取物对苹果炭疽病菌的抑制作用

2.5 多花黄精提取物对苹果炭疽病的防治效果

结果表明（表6），多花黄精石油醚提取物对苹果炭疽病的活体防效要强于丙酮提取物，而且保护作用明显强于治疗作用。在质量浓度为150g／L时，多花黄精石油醚提取物对苹果炭疽病的保护作用达到65.32%，治疗作用为43.95%。

表6 多花黄精提取物对苹果炭疽病的控制效果

3 结论与讨论

研究发现，多花黄精不同溶剂提取物对水果采后病原菌表现出不同程度的抑制作用。其中，石油醚提取物抑菌活性最强，对苹果炭疽病菌的抑制作用达到73.67%。用索氏抽提法提取的提取物对苹果炭疽病菌的抑制作用略高于回流提取物。多花黄精随着生长年份的延长，其提取物的抑菌活性表现一定的增强趋势，但4～6年多花黄精的活性差异并不大。多花黄精石油醚提取物对苹果炭疽病的防治效果强于丙酮提取物，保护作用明显优于治疗作用。

目前对植物源杀菌剂的研究与开发主要集中在两个方面：一是直接开发利用，即直接将有抑菌活性的植物加工为农药。二是间接开发利用，即在生物活性追踪指导下，提取分离植物中的活性成分，鉴定其分子结构，发现先导化合物，进行模拟合成，从中筛选新型农药［14］。我国黄精属植物有42种，占世界种类的70%左右［15］。黄精在我国已有2000多年的药用历史［16］。目前，黄精作为中药资源主要利用的是黄精多糖，分布在极性部分。王冬梅等曾利用硅胶、RP－18和Sephadex LH－20等色谱分离手段从卷叶黄精根茎的正丁醇萃取物中分离得到2个甾体皂苷化合物，其对植物病原菌和细菌均有一定的抑制效果［17］。本文发现多花黄精提取物中弱极性部分对苹果和梨炭疽病病原菌具有较强的抑制作用。综合石油醚的提取率及抑制效果，直接利用提取物的成本较高，从中发现活性成分进行合成开发新农药的途径更为适合。有关多花黄精中抑菌有效成分的纯化与鉴定正在进一步研究中。

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