北京地区发现番茄斑萎病毒

李 飞， 吴青君， 徐宝云， 谢 文， 王少丽， 张友军

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

西花蓟马［Frankliniella occidentalis （Pergande）］是世界性的、园艺作物上最重要的害虫之一［1］，2003年在我国首次发现并迅速上升为保护地蔬菜和花卉上的主要害虫之一［2］。西花蓟马除可以直接取食造成危害外，还能够传播多种植物病毒，西花蓟马是番茄斑点萎蔫病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）最有效的传播媒介，其传播病毒病造成的危害损失远大于其本身的危害。番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），于1915年由Brittlebank首次在澳大

利亚发现，现已在世界上多个国家和地区广泛分布，侵染烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣、菊花等作物及多种杂草等900多种植物，是全世界10种危害性最大的植物病毒之一［3］，在我国被列为进境植物检疫的危险性有害生物。虽然我国早在1984年就从花生上分离到 TSWV［4］，在四川晒烟上也发现TSWV的危害［5］，但其后的10多年来并未广泛流行，因此未有进一步的研究。近年来，在西花蓟马发生重灾区的云南，不断在花卉和烟草上检测到番茄斑萎病毒属病毒，并呈迅速蔓延之势，对云南的烟草和花卉产业已构成巨大威胁［6－7］。

2012年5 月，笔者在田间调查时发现西花蓟马为害严重的辣椒上出现枯斑、黄色环状纹等疑似番茄斑萎病毒病的症状，作者对海淀区疑似植物样品和西花蓟马发生严重的昌平地区的植物样品进行了鉴定，并测定了植物上发生的西花蓟马是否携带番茄斑萎病毒。

1 材料与方法

1.1 样品采集

辣椒叶片采于海淀区的2个日光温室和1个连栋玻璃温室内，叶片表现褪绿环斑、坏死斑、同心环症状，采回实验室立即鉴定。茄子样品采于昌平的日光温室，叶片表现黄绿不均，成斑驳状，上面有蓟马幼虫及为害状。分别从两种作物上采集50头左右蓟马，首先鉴定是否为西花蓟马，然后检测是否带毒。

1.2 主要试剂

Trizol总RNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RT－PCR试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq 10Master Mix，北京奥赛博科技发展有限公司；蛋白酶K，天根生化科技（北京）有限公司；树脂，Sigma公司；TSWV快速检测试纸条，安德珍生物技术（北京）有限公司。

1.3 蓟马种类的鉴定

蓟马基因组DNA的提取参照White等的方法并稍加改进［8］。将单头西花蓟马置于滴有3μL蛋白酶K parafilm膜上，以200μL PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液移入200μL PCR管，然后加入20μL的树脂，混匀之后置于37℃恒温水浴1 h，每隔15min振荡1次，然后金属浴96℃10min，于－20℃保存备用。西花蓟马的鉴定参照孟祥钦SCAR分子检测技术［9］，上游引物碱基序列为：5′－GAAACTACTATTGTTTGTGAGCTG－3′，下游引物 碱 基 序 列 为：5′－AAGAAACTAAC－GTGAAGGATACTC－3′。

1.4 TSWV快速试纸条检测

取一片3cm×4cm带有疑似症状的叶片，将叶片放入提取液瓶中，盖紧盖子用力摇动20s，直到液体变为暗绿色。然后用滴管将液体滴2滴到试纸条的点样孔中，大约30s后可以看到试纸条的窗口区变为蓝色，等到对照C线显现后，即可查看结果。如果T线显现，说明该样品为阳性，T线的颜色比较深说明带毒量比较高，颜色浅说明带毒量少，如果没有T线，说明该样品为阴性。

1.5 RT－PCR检测

参考天根的Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取叶片及西花蓟马的总RNA，样品于－80℃保存备用。然后按照TaKaRa RT－PCR试剂盒说明书进行cDNA的合成，－20℃保存样品。采用Vaira等［10］设计的引物：NF302：5′－GGGTCAGGCTTGTTGAGGAAAC－3′ 和 NR575：5′－TTCCCTAAGGCTTCCCTGGTG－3′。PCR 反应体系为 20μL：cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×Taq10Master Mix 10μL、ddH2O 7μL，PCR程序为94℃预变性2min；40个循环：94℃30s、60℃30s、72℃30s；最后72℃延伸5min［11］。扩增后的产物用1.5%凝胶电泳检测，预测条带为273bp。

将PCR产物交由北京六合华大基因科技股份有限公司（BGI）测序，将获得的序列通过BLAST进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 蓟马种类的鉴定

以蓟马的DNA为模板，以2条SCAR引物：FOMF／FOMR分别进行扩增。电泳检测结果显示，能扩增出一条西花蓟马特有的条带，得到320bp左右的目的片段（图1），表明上述植物上发生的蓟马种类为西花蓟马。

图1 蓟马种类鉴定结果电泳图

2.2 TSWV试纸条检测结果

用滴管将叶片提取液滴2滴到试纸条的点样孔中，约30s后可以看到试纸条的窗口区变为蓝色，大约2min后对照C线显现，具有褪绿环斑的叶片均显示T线（图2a），表明该叶片均带有番茄斑萎病毒。而症状轻的叶片，T线不明显（图2b），需进一步验证。

2.3 RT－PCR检测结果

采用引物NF302／NR575对番茄斑萎病毒属病毒N基因序列进行RT－PCR扩增，表现褪绿环纹症状的辣椒叶片样品、症状不明显的辣椒和茄子样品以及同时采集的西花蓟马均可获得273bp左右的目的条带（图3、图4），与预期结果一致，表明采集的辣椒、茄子样品可能被番茄斑萎病毒侵染，西花蓟马可能携带番茄斑萎病毒。

图2 TSWV试纸条检测

2.4 获得目的片段的序列比对

将测得的目的基因片段进行序列测定，通过BLAST比对发现所扩增的273bp与番茄斑萎病毒属病毒的N基因序列有98%的相似性，进一步证明上述植物样品的确受番茄斑萎病毒属病毒侵染，而且蓟马体内也携带番茄斑萎病毒属病毒。

3 讨论

通过采用番茄斑萎病毒的快速试纸条检测，以及进一步的RT－PCR和序列测定证实，在北京局部地区的辣椒和茄子上已发生番茄斑萎病毒病，这两种作物上同时发生的蓟马种类主要为西花蓟马，并且携带该病毒。由蓟马传播的番茄斑萎病毒位列世界10大重要病毒病的第2位［3］，曾对西班牙东南部的温室番茄、辣椒和花卉造成的经济损失达到50%［12］，在美国夏威夷、巴西、意大利和南非，番茄斑萎病毒病在20世纪80－90年代的某些年份流行导致番茄、莴苣等作物近乎绝产［13］。众所周知，西花蓟马目前已遍布我国北京、云南、山东、贵州、新疆等地［14］，对各地的蔬菜和花卉作物造成严重危害。世界各国的事实表明，伴随西花蓟马在世界范围内的广泛传播与扩散，常导致番茄斑萎病毒病的发生与流行。如果由西花蓟马传播的番茄斑萎病毒病大面积发生，加上种苗调运的远距离传播，将对我国农作物特别是经济价值高的蔬菜和花卉作物生产造成毁灭性的灾害。为此，建议有关部门立即采取相应的预防与管理措施，首先查明番茄斑萎病毒病在我国的分布现状，同时开展相应的控制技术研究，防止其扩散蔓延。

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