嗜酸乳杆菌细菌素的分离纯化及表面活性剂对其活性的影响1）

张帅，王金凤，马永强

（哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨150076）

细菌素（bacteriocin）是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，主要含有具生物活性的蛋白质部分，对同种近缘菌株呈现狭窄的活性抑制谱［1］。由于细菌素可被人体消化道中的一些蛋白酶（如胰蛋白酶）所降解，不会在体内蓄积而引起不良作用。而且其具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏［2］；对食品的口感、味等无不良影响；它的使用可以减弱杀菌强度，减少杀菌时间，有利于保持食品原有的营养价值和风味。

随着社会进步和全民食品健康、安全意识的增强，广大消费者越来越关心食品的安全性问题。在欧洲、日本等国家微生态制剂，引起高效性和安全性受到广泛瞩目。科学工作者已就细菌素的稳定性及生理生化等方面进行了较为深入的研究。研究结果显示，细菌素不但具有抗细菌、抗真菌的作用，还具有抗寄生虫等方面的功能，在食品保鲜方面，可望成为替代某些化学合成抑菌剂的物质［3］。

嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）是天然存在于人和动物的胃肠道的益生菌，属于乳杆菌科乳杆菌属（Lactobacillus），对维持胃肠道的生理功能有重要作用［4］。通过对嗜酸乳杆菌中细菌素的分离纯化的研究，为食品的保鲜材料提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus，分离自开菲尔粒）

指示菌株：德氏乳杆菌（L.delbrueckiisubsp.lac－tis，DSM 20076，S＋）

本研究使用的冻藏菌株使用前活化2次，使用MRS肉汤培养基（接种量2%），37℃培养24h。

琼脂平板培养基：琼脂粉1.5%（w／v）。

软琼脂培养基：向肉汤培养基中加入琼脂粉0.75%（w／v）。

产细菌素培养基：MRS肉汤培养基配方中用油酸替代 Tween 80，油酸用量为0.1%（v／v）。

1.2 实验仪器

恒温培养箱，1L磁力搅拌玻璃发酵罐，大容量低温离心机，层析柱，自动部分收集器，紫外检测器，0.45μm醋酸纤维素滤膜。

1.3 实验方法

1.3.1 嗜酸乳杆菌的培养

1.3.1.1 生长曲线与细菌素活力曲线

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）首先被活化2次，然后分别在MRS和产细菌素培养基中培养。向1L液体发酵罐中加入750mL需要的培养基，接种量2%，培养温度37℃，振荡速率150r／min。体系pH通过pH控制装置流加12%氨水来使之恒定为pH6.0。每次取10mL样品进行分析，根据24h内的不同培养时间对细胞数（菌液的OD值）和细菌素活性作图。

1.3.1.2 细菌素的发酵

L.acidophilus首先被活化2次，然后分别在MRS和产细菌素培养基中培养。向1L液体发酵罐中加入750mL需要的培养基，接种量2%，培养温度37℃，振荡速率150r／min。体系pH通过pH控制装置流加12%氨水来使之恒定为pH6.0。培养16h后，用盐酸调节培养基pH5.0，然后离心除去细胞（4000×g，10min），上清液冷藏于－20℃，以备细菌素检测和分离纯化［5］。

1.3.2 细菌素活性检测

培养液的细菌素活性检测采用抑菌圈法，MRS琼脂培养基，德氏乳杆菌（L.delbrueckii）为指示菌株。

指示菌株制备：向5mL软MRS琼脂培养基中加入经10倍稀释，并放置过夜的指示菌L.delbrueckii培养液0.125mL。试管内容物混合均匀，倾倒在预先铺好的MRS琼脂平板上。细菌素样品使之通过0.45μm醋酸纤维素滤膜达到灭菌作用。

活性的测定采用临界稀释法，通过连续两倍稀释的培养液来检验指示菌的生长状况。活性通过能产生明显透明区的最大稀释度的倒数来表示，活性单位（AU）每毫升培养液。测定结果通过下式计算：C＝（1000／d）×D，C是细菌素溶液浓度 AU／mL，D是稀释倍数，d是试样量（即每点取用的细菌素溶液量）。

1.3.3 细菌素的盐析分离

嗜酸乳杆菌在pH6.0的产细菌素培养基中恒温培养，离心分离细胞，上清液在4℃下用新华一号滤纸过滤，以使油酸与细菌素分离。存在于上清液相中的细菌素采用硫酸铵盐析法（400g／L）粗分离，硫酸铵与上清液混合物在4℃下冰箱内静置过夜，离心（8000×g，30min）分离沉淀物。收集的沉淀物然后再复溶于0.05M醋酸钠缓冲液（pH5.0）中，4℃下用截留分子量为1kDa的膜对相同的缓冲液透析过夜，得组分Ⅰ。

1.3.4 细菌素的纯化

采用 carboxymethyl（CM）－Sepharose 柱 （2cm×8.5cm），用0.05MpH5.0乙酸钠缓冲液平衡，平衡液流速1mL／min。待组分Ⅰ上样后，用0.073M pH5.0乙酸钠缓冲液洗脱，至在280nm波长处无吸收检出。

细菌素的纯化采用梯度洗脱（0.073MpH5.0乙酸钠缓冲液中溶有0～0.6MNaCl）。取3mL洗脱组分进行抗微生物检验。收集具有活性的组分，对20mM磷酸钠缓冲液（pH5.8）透析得组分Ⅱ。

向组分Ⅱ中加入硫酸铵，至终浓度达10%，随后用为含10% 硫酸铵20mM磷酸钠缓冲液（pH5.8）平衡的octyl－Sepharose CL－4B柱（1cm×6.5cm）进行分离。用平衡缓冲液洗后，细菌素用含20mM磷酸钠缓冲液（pH5.8）的50%乙醇洗脱。收集具有活性的组分，冷冻干燥得组分Ⅲ。

1.3.5 表面活性剂对细菌素活性的影响

在细菌素发酵过程中，向培养基中加入下列表面活性剂：吐温Tween 20，Tween 80，Triton X－100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P－40），SDS，尿素，溴化十六烷基－三甲基胺 （hexadecyl－trimethylammonium bromide），N－月桂酰肌氨酸（N－lauroylsarcosine）和β－巯基乙醇（β－mercaptoethanol），所有的表面活性剂的最后浓度均为1%。为了减少二硫键还原对细菌素活性的影响，细菌素检验中加入二硫苏糖醇（DTT，终浓度1mM）。对照由细菌素和表面活性剂及50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）组成。所有样品及对照均在37℃预热6h，然后测定细菌素浓度。

为了观察Tween 80的效果，培养过程中不加Tween 80，发酵后离心去除细胞后的培养基质经4℃过滤去除油酸后，加入Tween 80，浓度分别为0、0.05、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5（v／v）。然后样品及对照在37℃预热6h，然后测定细菌素活力。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌的生长曲线与细菌素活力曲线

图1 嗜酸乳杆菌生长曲线

图2 细菌素活性变化曲线

由图1和图2可以看出，在嗜酸乳杆菌的培养过程中，在8h后，开始进入对数生长期，而在对数生长期的后期稳定期开始时，开始出现细菌素抑菌活性的高峰，具体时间是在16h左右达到最大的抑菌活性而且会持续到24h。在相关研究中，发现如果去除培养基中的Tween 80等表面活性剂或油酸，嗜酸乳杆菌的产细菌素能力会大大下降，有的研究者称其原因是这些物质除具有乳酸菌生长促进剂的作用外，其乳化特性可能还会影响微生物细胞产生的亲水性或疏水性小肽的生物活性。

2.2 细菌素的纯化

表1 细菌素的纯化进程表

细菌素的纯化程序包括3个步骤：硫酸铵沉淀、离子交换色谱（IEC）和疏水作用色谱（HIC）。纯化进程如表1。由上表可以看到该纯化程序是有效的，但是在IEC和HIC之间，纯化倍数较低。结合其他研究者的相关论述，该细菌素的水溶性应该是较低的，这也从另一个角度提示，Tween 80能够促进其抑菌活性，应该与提高了其在溶液相中的分散性有关。此外有些研究者报告了采用电泳方法进行进一步分离失败的情况，证实了其在水为媒介的缓冲液中的溶解能力极低。

2.3 表面活性剂对细菌素活性的影响

由表2的结果可以得出这样的结论，阴离子表面活性剂如SDS，是通过与蛋白天然结构中的内部疏水区的配位作用使得蛋白结构被打开，从而影响蛋白质的立体结构。在这种情况下，加入两种阴离子表面活性剂中的任何一种（SDS和N－月桂酰肌氨酸）都会使抑菌能力提高；非离子表面活性剂的作用则因化合物而异，Triton X－100和 Nonidet P－40可以提高其抑菌能力，而Tween20不会对抑菌作用产生影响，Tween 80甚至使抑菌能力下降；阳离子表面活性剂对抑菌活性的影响也各不相同，溴化十六烷基－三甲基胺能使抑菌能力大幅度提高，β－巯基乙醇也会使抑菌能力显著降低，但是加入DTT和尿素却观察不到细菌素活性的明显变化。DTT存在情况下对细菌素活性没有影响这一事实说明，在其分子中不存在二硫键，这与某些研究者在细菌素氨基酸构造成的报告中，关于不存在胱氨酸的结论是一致的。而溴化十六烷基三甲胺阳离子的作用应该是极特殊的例证，已经不能简单用表面活性剂的非特异性的影响来解释了。

研究还发现Tween80使细菌素活性降低的程度是具有浓度依赖关系的。当加入的Tween80的浓度在一定范围内提高时，细菌素的活性会进一步降低，但超过某一限值，继续增加Tween80的浓度时，细菌素的活性却不再继续降低了。这一结果说明，表面活性剂不仅直接影响细菌素肽结构，当其浓度达到某一限量时也会提高检验菌株的抗性。

3 结论

通过嗜酸乳杆菌的发酵实验研究表明，嗜酸乳杆菌在添加了油酸的MRS培养基中培养16h后达到产细菌素高峰；对发酵基质中的细菌素分离纯化研究包括三个步骤：硫酸铵沉淀、离子交换色谱（IEC）和疏水作用色谱（HIC）。阴离子表面活性剂都会使抑菌能力提高；非离子表面活性剂的作用则因化合物而异；阳阴离子表面活性剂β－巯基乙醇也会使抑菌能力显著降低，但是加入DTT和尿素却观察不到细菌素活性的明显变化。而十六烷基溴化三甲胺阳离子的作用应该属特殊的例证，尚有待进一步研究。Tween80使细菌素活性降低的程度是具有浓度依赖关系的。当加入的Tween80的浓度在一定范围内提高时，细菌素的活性会进一步降低，但超过某一限值，继续增加Tween80的浓度时，细菌素的活性却不再继续降低了。

［1］ 叶巍，霍贵成.乳酸菌细菌素应用研究进展［J］.乳业科学与技术，2006（2）：56－58.

［2］ 张艾青，刘书亮，敖灵.产广谱细菌素乳酸菌的筛选和鉴定［J］.微生物学通报，2007（4）：112－120.

［3］ 石金舟，陈丽园，张明，等.1株产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定［J］.中国微生态学杂志，2005（6）：75－79.

［4］ 张大为，吕嘉枥.嗜酸乳杆菌WS所产细菌素生物学特性的研究［J］.食品工业科技，2005.（7）：70－71.

［5］ Deraz S，Karlsson NE，Hedstr·mM，Andersson MM，Mattiasson B.Purification and characterisation of acidocin D20079，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079［J］.J Biotechnol.2005，117：343－354.