白藓粗取物体外抗菌作用初步研究1）

纪春艳，任荣，柴军红，李然红，王立凤

（牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江157012）

白藓 （DictamnusdasycarpusTurcz.）为芸香科白藓属的多年生宿根草本植物。白藓根皮可供药用，具有祛风化湿、止痒、清热解毒之功效。［2－3］目前对白藓根皮的成分、药理等已有一定的研究，但对白藓茎叶和种壳的研究报道很少。笔者分别以白藓茎叶和种壳为材料，采用95%的乙醇水溶液提取，提取液经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取并对其萃取物的抑菌活性进行了研究，通过抑菌活性部位追踪，以期为寻找新的具有抑菌活性的中药资源提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验样品

白藓全草采集于牡丹江市镜泊湖熔岩地区，经鉴定为芸香科白藓属植物。

1.2 供试菌种

大肠杆菌 （Escherichiacoli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），普通变形杆菌（Proteusvulgaris），枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）均由牡丹江师范学院生命科学与技术学院微生物学实验室提供。

1.3 培养基

LB（Luria－Bertani）固体培养基：45g营养琼脂加1000mL蒸馏水煮沸后定容。于121℃灭菌20min。

LB液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、调pH7.2～7.4于121℃灭菌20min［4］。

1.4 仪器与试剂

1.4.1 仪器。旋转蒸发仪（上海亚荣 RE－52AA），SHB－3循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂），真空干燥箱（沈阳林频设备实验公司），电子天平（上海分析仪器厂），高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），超净工作台（苏州洁净技术研究所制造），电热恒温培养箱（北京科伟医疗器厂），架盘天平（上海精密科学仪器有限公司）等。

1.4.2 试剂。二甲基亚砜DMSO，由天津市化学试剂一厂生产；头孢氨苄霉素（批号：20100209），由哈药集团三精制药四厂生产；丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和正丁醇等化学试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 白藓茎叶提取液的制备

采用溶剂冷浸法：将采集的白藓全草清洗干净、阴处晒干，挑选出其中的茎叶，粉碎、过筛。准确称取313g干粉，放入锥形瓶中，按料液比1∶5加入95%的乙醇水溶液，然后于室温下浸提24h，浸提过程每隔2h搅拌一次，抽滤。重复3次，将滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液A0为450mL。密封保存于4℃冰箱中备用。

2.2 白藓茎叶不同溶剂提取物的制备

采用液－液萃取法：将提取的浓缩液依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并3次萃取液，减压浓缩至蒸干溶剂，分别获得石油醚萃取相（A1）、氯仿萃取相（A2）、乙酸乙酯萃取相（A3）、正丁醇萃取相（A4）和水萃取相（A5）。

2.3 白藓种壳提取液的制备

采用溶剂冷浸法：挑选出阴干的白藓种壳，将其粉碎、过筛。准确称取235g种壳干粉，放入锥形瓶中，其浸提方法同白藓茎叶。最后得浓缩液B0为250mL。密封保存于4℃冰箱中备用。

2.4 白藓种壳不同溶剂提取物的制备

采用液－液萃取法：方法同2.2。最终获得白藓种壳石油醚萃取相（B1）、氯仿萃取相（B2）、乙酸乙酯萃取相（B3）、正丁醇萃取相（B4）和水萃取相（B5）。

2.5 样品的制备

准确称取 A2、A3、A5、B2、B3、B5，分别溶于 DMSO中配制成25mg／mL的溶液。头孢氨苄霉素（T）配制成10mg／mL作为阳性对照。每种样品经微孔滤膜（孔径0.22μm）过滤灭菌后待用。A1、A4、B1、B4萃取物质量太少，因此未被选用。

2.6 菌液的制备

在无菌室中将供试菌种移接入相对应的试管斜面培养基上，进行活化，细菌置于37℃培养箱中培养24h，用无菌水配制成1×107～1×108CFU／mL的菌液。

2.7 体外抑菌试验 （滤纸片法）［5］

用打孔器将滤纸打成直径为10mm的圆纸片，121℃灭菌30min，在每种待测样品中浸入无菌滤纸片，充分浸泡后取出、晾干。在超净工作台上将灭菌后的固体培养基倒入无菌培养皿中，每皿20mL左右。待冷却凝固后，加入制备好的菌悬液各0.1mL用涂布棒将菌液涂布均匀。用无菌镊子夹取含样品液的滤纸片贴在培养基表面。每皿贴3片，每个菌种3次重复，放在37℃恒温培养箱中培养24h，用游标卡尺测定其抑菌圈直径，取3个平行的平均值。以DMSO做为空白对照。

2.8 最低抑菌浓度（M IC值）的测定［6］

以A2为例：在无菌条件下将灭菌试管分成4组，每组9支。向每组的第1支试管中加入2mL 2倍浓度的LB液体培养基，第2～7支试管中各加入2mL LB液体培养基；向每组的第1支试管中加入2mL A1样品液，混匀后吸出2mL加至第2号试管中，如此稀释至第7管，从第7管中吸出2mL弃去，使各管药液浓度分别为5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.078mg／mL，然后，向各管中加入0.1mL的菌液，第8支试管中加入2mL LB液体培养基不加样品液作为阳性对照，第9支试管中加入提取液但不加菌悬液作为阴性对照，于37℃培养24h，观察抑菌效果。试验重复3次。液体培养基透明为无菌生长，混浊为有菌生长。以无菌生长的最低样品液浓度作为最低抑菌浓度（MIC）。对不宜判定有无细菌生长者，在营养琼脂平板上划线接种，37℃恒温培养24h后取出，以完全无细菌生长的平板所对应的样品液浓度作为此样品液对该菌株的最小抑菌浓度（MIC）。其余样品操作方法如A2。

3 结果与分析

3.1 滤纸片法测定白藓茎叶及种壳粗提物的抑菌作用

按照“2.7”操作，结果见表1。从表1可知，各提取液对变形杆菌抑菌作用较小，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌作用。A2的抑菌圈直径：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草杆菌，变形杆菌无抑菌效果。A3的抑菌圈直径：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞变形杆菌＞枯草杆菌。B2的抑菌圈直径：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞变形杆菌＞枯草杆菌。B3的抑菌圈直径：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草杆菌，对变形杆菌无抑菌效果。其中金黄色葡萄球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、变形杆菌为革兰氏阴性菌。

A2、A3、B2、B3的抑菌结果趋势基本一致，且四者对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用较变形杆菌和枯草杆菌的抑菌作用强。

表1 白藓茎叶及种壳氯仿相乙酸乙酯相滤纸片法的抑菌结果

3.2 白藓茎叶及种壳各萃取相对供试菌的最低抑菌浓度

由表2可知：A2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌的最小抑菌浓度相同，均为3.13mg／mL，且对变形杆菌无抑菌效果；A3对大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌的最小抑菌浓度均为3.13mg／mL，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其最小抑菌浓度为1.57mg／mL。B2对供试菌的最小抑菌浓度分别是金葡菌1.57mg／mL、大肠杆菌1.57mg／mL 、枯草杆菌3.13 mg／mL、变形杆菌3.13mg／mL。B3对供试菌的最小抑菌浓度分别：金葡菌1.57mg／mL、大肠杆菌1.57mg／mL、枯草杆菌3.13mg／mL，且对变形杆菌无抑菌效果。其中金黄色葡萄球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、变形杆菌为革兰氏阴性菌。

阳性对照均没有抑菌活性，阴性对照均为无菌生长。符合抑菌实验要求。

表2 白藓茎叶及种壳粗提物对供试菌的最小抑菌浓度

4 结论与讨论

分别对白藓茎叶及种壳粗提物的氯仿相（A2及B2）和乙酸乙酯相（A3及B3）提取物做了抑菌实验和最小抑菌浓度实验。试验结果表明：氯仿相和乙酸乙酯相对四种菌都具有不同程度的抑菌效果，但抑菌效果不同。A2、A3、B2、B3对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌显示了较好的抑菌效果，对枯草杆菌也表现出了一定的抑制活性。此外，白藓茎叶及种壳对大肠杆菌的抑制作用主要表现在其中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相。A2和B3对变形杆菌无抑菌效果，可能是由于量较低，在该试验的质量浓度范围内尚不足以较好的抑制变形杆菌增殖。

该研究对牡丹江镜泊湖火山熔岩地区的白藓植物进行了探索研究，初步揭示了白藓对4种常见菌种的有效抑菌部位。这为今后对其抑菌活性成分的进一步分离与分析奠定了基础，预示其具有作为抑菌活性剂进行开发的价值。

［1］ 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（上册）［M］.北京：人民卫生出版社，1988.

［2］ 《中医辞典》编辑委员会.简明中医辞典［M］.北京：人民卫生出版社，1980.

［3］ 严仲铠，李万林.中国长白山药用植物彩色图志［M］.北京：人民卫生出版社，1997.

［4］ 黄秀梨.微生物学实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2004（8）：6－8.

［5］ 段江莲，徐建国.桑椹红色素抑菌作用的研究［J］.食品科学，2007，28（10）：87－89.

［6］ 李芳.复方芸香片的体外抑菌作用实验研究［J］.时珍国医国药，2001，12（11）：971－972.