高效液相色谱法测定鱼饲料中甲基睾丸酮含量的研究

马 丹 高丽娜 陈永平 李春青

17α-甲基睾丸酮 (17α-methyltestosterone,MT，见图1)是一种人工合成的雄激素类药物，具有增强雄性体性特征和蛋白同化双重作用，从小喂食可以改变鱼体的性别，多年来广泛施用于水产养殖的苗种培育和性别控制等方面。在水产养殖中，单性养殖生产技术具有鱼体成活率高、产量高、成本消耗低、质量优等特点，而雄性是单性鱼体养殖中的最佳性别，无论在饲养周期、个体大小、色泽体型等方面都优于雌性鱼体，所以在鱼饲料中掺入17α-甲基睾丸酮，是最快捷方便有效的雄性化鱼苗的方法。应用中最常见的养殖鱼类就是产量居世界排名第二的罗非鱼，随着应用技术的成熟，也广泛应用于对虾类、蛙类、甲鱼等养殖水产品中。但是17α-甲基睾丸酮作为雄性激素添加于饲料中被动物摄入，如果一味追求养殖动物的成熟时间而在鱼体内并未消解完全，被人类食用而进入人体，即使微小的含量，作为雄性激素也会对人类的健康产生不利的影响，会扰乱人体内激素平衡，引起妇女出现类似早孕的反应及乳房肿胀、不规则出血等，影响肝脏功能，导致新生儿畸形、溶血及黄疸等，对成人也有致癌作用。由于甲基睾丸酮有着巨大的潜在危害，欧盟95/22/EC规定禁止使用雄性激素兽药，美国也规定其同类的丙酸睾酮在肌肉中的最大残留限值(MRLs)为0.64 μg/kg，我国农业部235号公告发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定其为禁止使用兽药，在所有动物性食品的所有可食组织中不得检出。

本文旨在建立和优化MT在饲料中的检测方法，利用 3β-methoxy-17β-hydroxyandrost-5-en-7-one[3β-甲基-17β-羟基-5-雄烯-7-酮，见图1（2）]作为内标（I.S.），建立了高效液相色谱测定饲料中的17α-甲基睾丸酮方法。此方法在254 nm限定波长的条件下能够定量分析鱼饲料中MT。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（Aglient 1200全自动进样器、二极管阵列检测器），电子分析天平XS1050型(METTLER TOLEDO公司)，台式离心机 3K15型(SIGMA公司)，氮吹仪N-EVPA 112型，旋涡振荡器G560E型(Scientific Industries.Inc)，固相萃取柱 Oasis-HLB型3cc Waters公司。

1.2 药品与试剂

17α-甲基睾丸酮(17α-methyltestosterone，纯度大于99%)(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生产)，鱼饲料，3β-甲基-17β-羟基-5-雄烯-7-酮 (I.S.)(于相关实验室合成，245 nm紫外波长下纯度＞99.5%)，甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、甲酸、乙酸（均为色谱纯），纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司生产)。

1.3 色谱条件

WatersXterraRP18色谱柱（150mm×4.6 mm×5 μm）；检测波长 254 nm；流动相水-乙腈(80： 20，V/V)；流速0.5 ml/min；柱温 40 ℃；进样量 10 μl。

1.4 标准溶液配置

MT标准储备液：准确称取15.00 mg MT用甲醇定容于100 ml容量瓶中，配置成0.15 mg/ml浓度的MT标准储备液，于0～4℃避光储存，试验前稀释至不同浓度制成标准曲线。

内标溶液：相同方法配置3.0 mg/ml浓度的内标溶液3β-甲基-17β-羟基-5-雄烯-7-酮，稀释 10倍，得0.3 mg/ml的内标溶液。

1.5 样品测定

1.5.1 提取

先将鱼饲料样品粉碎过40目筛，用四分法称取5 g饲料样品（精确到0.000 1 g）于50 ml聚丙烯离心管中，与外标MT充分混匀，静置20 min后向离心管中加入3 ml正己烷，涡旋20 s使之混合均匀，然后再依次加入 12 ml甲醇和 0.1 ml内标溶液（30.0 μg/ml），涡旋两次，每次20 s，使其充分混匀，静置后加入3 ml水，重复涡旋两次20 s，以5 000 r/min离心10 min，准确吸取2 ml上层甲醇-水溶液于15 ml聚丙烯离心管中。

1.5.2 净化

加2 ml正己烷洗涤离心管中提取液，剧烈震荡涡旋20 s，静置后除去正己烷层，用氮气在40℃条件下将甲醇-水层浓缩至0.3 ml左右，加水稀释至3 ml，将样液全部移入预先用2 ml甲醇和2 ml水活化的固相萃取管中深层净化，先后加入含有2%乙酸的1：1甲醇-水混合液1 ml洗涤两次，抽干柱中溶液，再用甲醇洗涤两次，每次加入1 ml，一齐并入15 ml聚丙烯离心管中，再加入稀释水(4.0±0.1)ml定容到10 ml，以5 000 r/min离心5 min，取0.5 ml清液于2 ml自动进样瓶中，上机分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

首先用甲醇提取鱼饲料中的MT，其中包含样品中的油和脂肪等成分，经过正己烷洗涤后可除去溶解于甲醇中80%的油脂，然后将甲醇水层蒸干再加入蒸馏水移于固相萃取进一步净化，以水-乙腈为流动相运用内标方法测定分析鱼饲料中MT的含量。

2.2 方法专属性

内标结构式与MT近似，其吸收峰可以清晰地与MT吸收峰区分开（见图2），是比较理想的内标化合物。鱼饲料样品经过前处理，提取液不会影响MT及内标出峰的保留时间，MT和内标亦不会互相干扰。结果得出（见图3、图4），加标样品中内标和MT色谱峰的平均保留时间（n=8）分别是8.68 min(R.S.D=0.19%)和11.29 min（R.S.D=0.20%），具有较强专一性。

2.3 线性范围及定量限

稀释 MT储备液分别配置成 7.5、15.0、30.0、45.0和60.0 μg/ml 5个系列浓度的甲基睾丸酮标准液，按照1.3中色谱条件进行分析，以样品与内标面积比(X)对相应的样品与内标浓度比(Y)进行线性拟合，拟合方程为：Y=1.276 3X+0.031 8，R2=0.999 8，在 7.5～60.0 μg/ml范围内具有良好的线性关系。本方法的定性检出限为1.3 mg/kg（S/N=3），定量检出限为 3.4 mg/kg（S/N=10）。

2.4 回收率

渔业养殖推广技术建议鱼饲料中17α-甲基睾丸酮的添加量为60 mg/kg，既可以有效地控制鱼体的性别又能够使成鱼上市后在鱼体内的药物消解完全，所以取标准添加量的25%、100%、200%作为加标水平，即15、60、120 mg/kg。相对回收率通过内标来换算，范围在94%～100%之间，相对标准偏差最小值为1.97%，最大值为3.21%，具体结果见表1。

表1 鱼饲料中17α-甲基睾丸酮的回收率（%，n=5）

2.5 准确性与精密度

15、60、120 mg/kg 3个浓度的加标水平在鱼饲料样品中17α-甲基睾丸酮检测的批内及批间结果考察方法的准确性及精密度，结果见表2。批内的回收率不低于97%，相对标准偏差在0.64%～2.31%之间，批间的回收率不低于98%，相对标准偏差不大于2%。

表2 准确性与精密度测定结果

2.6 稳定性

对检测方法的细节稍作上下浮动10%的改变来考察本方法的稳定性，具体变量条件为：①(12.0±1.0)ml甲醇提取鱼饲料中MT和内标；②向甲醇中加入(即增加或减少10%)的蒸馏水以去除油和脂肪；③洗涤固相萃取管中甲醇浓度变化±10%；④改变水-甲醇中加入乙酸的浓度±25%；⑤改变最后从萃取管中洗脱MT和内标所用的甲醇体积±10%；⑥分别使用两种固相萃取柱填充物；⑦使用两种填充物的反相C18柱；⑧使用不同尺寸的C18柱；⑨25℃和40℃柱温下进行试验。各做3次平行试验，以MT和内标的峰面积及比值表示结果，并用F检验（ANOVA）分析判定。结果表明，前4个条件的改变对试验结果影响不大，固相萃取柱的更换和温度变化亦不会使目标物质的峰面积和线性产生重大变化，MT的F检验值范围0.3～4.5，内标的F检验值范围0.1～2.7。唯一对本方法有影响的变量条件是洗脱固相萃取柱所用的甲醇含量，10%的变化区间对内标的洗脱有明显影响，而对MT的洗脱效果改变不大，甲醇含量45%时不能使内标物质全部洗脱出来，导致MT与内标的峰面积比值较大；而在甲醇≥50%含量时，达到最大值，所以导致MT与内标的峰面积比有较大变化（见图5）。

3 讨论

3.1 检测方法的选择

渔业养殖推广技术推荐雄化期用鱼饲料中平均添加60 mg/kg的甲基睾丸酮含量，能够有效地控制鱼体雄性化，并能在成鱼后基本消解完全。有文献报道，在饲料中添加200 mg/kg质量浓度的甲基睾丸酮，能够起效的同时，使罗非鱼在上市前体内基本消解完全。本试验是对在使鱼体雄变的功能性饲料中添加甲基睾丸酮含量的检测，其较养殖期、上市期产品及非功能性饲料中的含量高出几十倍，故前处理及检测方法与国标GB/T 22260—2008不相同，本试验参考美国药典关于功能性饲料中MT的检测方法，灵敏度范围相对较大，相应地，检测值范围也更宽阔。

3.2 甲基睾丸酮的降解

在高温条件下，甲基睾丸酮在不同pH值环境下会降解成不同产物。通过UV和LC-MS（液质联用）的方法研究MT样品发现，在甲醇-水溶液的中性环境下，升温到70℃加热1 h，超过98%的MT基本没变化；在酸性条件下，得到其脱水产物[见图6(2)]；在碱性条件下，主要的降解物为极性氧化产物，可能为烯丙基的氧化酮类混合物[见图6(3)]，本试验也对含有降解产物的样品进行检测，得出降解产物对MT和内标的保留时间都不会产生影响，所以本方法是安全可行的，在样品成分、杂质、降解产物等共同存在的混合物中能够高度准确地测定出结果。

3.3 其他动物饲料

在观赏鱼饲料中添加甲基睾丸酮，可以使观赏鱼增色，色彩变得鲜艳亮丽；添加在猫饲料中使宠物猫皮毛鲜亮，身形矫健等，都属于能够增强动物观赏性的功能性饲料，如果这些饲料与上述试验方法中与各物质出峰不冲突，并且含量大致在检测范围之内，理论上都可以作为检测MT的方法，这些还有待进一步研究探索。

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