环境激素睾丸酮、孕酮对萼花臂尾轮虫繁殖的影响

周西　季亚培　黄文婷

摘要：研究了在种群试验条件下，睾丸酮和孕酮对萼花臂尾轮虫生殖参数（受精率、混交雌体比率、休眠卵/雌体百分率）的影响。结果显示，睾丸酮的48 h-EC50、NOEC、LOEC分别为511.0、0.1、1.0 μg/L。睾丸酮为10 μg/L时，可显著诱导萼花臂尾轮虫混交雌体和休眠卵的产生；100、1 000 μg/L时，添加睾丸酮能使萼花臂尾轮虫的休眠卵孵化率分别显著提高83.67%、85.71%；100 μg/L时，可使轮虫交配率提高87.5%。孕酮的48 h-EC50为4.3 mg/L，2.0 mg/L 的孕酮可使萼花臂尾轮虫的种群增长率提高20.89%；2.5 mg/L时最适宜促进混交雌体和休眠卵的产生；2.5、3.0 mg/L时可使萼花臂尾轮虫的孵化率分别提高51.98%、1.47倍；3.0、3.5 mg/L时可显著提高轮虫受精率。

关键词：萼花臂尾轮虫；睾丸酮；孕酮；混交雌体；生殖参数

中图分类号： X171.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0286-04

萼花臂尾轮虫（Brachionus calyciflorus）具有分布广、繁殖快、易培养等特点，是淡水生态系统的重要组成部分，其休眠卵可通过商业渠道获得。20世纪70年代，轮虫被推荐作为生态毒理受试动物[1]；20世纪90年代，萼花臂尾轮虫、褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）分别被美国试验材料协会（American Society for Testing and Materials，ASTM）采纳，正式成为淡水、海水生态毒理研究的标准受试动物[2]。甲基睾丸酮、孕酮是由脊椎动物分泌的类固醇激素，进入水体中会对生物内分泌产生干扰。轮虫受精和休眠卵产量等受内分泌机制的调控，因此其生殖指标可作为测定环境激素对水生无脊椎动物内分泌干扰的有效方法。已有研究证实，轮虫的生长生殖可受一些环境激素的影响[3-4]。一定浓度孕酮可增加臂尾轮虫（Brachionus manjavacas）产休眠卵的数量并明显降低其内禀增长率[5]。氰戊菊酯（fenvalerate）、三丁基氯化锡（TBTC）对萼花臂尾轮虫生命周期中各发育阶段历时和种群增长均有显著影响[6]。然而，已有研究多建立在环境效应药物上，即具有雌性或雄性效应的药物，而关于外源性哺乳动物分泌的性激素对萼花臂尾轮虫生长生殖的影响鲜有报道。研究在睾丸酮、孕酮等典型类固醇激素作用下萼花臂尾轮虫生殖情况的变化，并分析各种参数，寻找性激素对轮虫生殖干扰的参考指标，以期为轮虫繁殖生物学与生态毒理学的结合提供新的研究思路。寻求适当的激素刺激，以促进轮虫由无性生殖向有性生殖转化，从而提高其休眠卵产量，在生产中具有实践意义。

1 材料与方法

1.1 轮虫的预培养

试验采用萼花臂尾轮虫（Florida，USA，1983品系）的冷冻休眠卵，于24孔塑料培养板中孵化，每孔加入0.8 mL EPA培养基[7]（蛋白核小球藻的浓度控制在3.0×106～3.5×106 个/mL），进行单克隆培养。挑取龄期小于4 h且活泼健壮的新生幼体进行试验。轮虫的培养条件为光照度约4 000 lx、光—暗周期16 h—8 h、温度（25±1） ℃。

1.2 试验药品的配制

采用丙酮溶液作为溶剂，分别将甲基睾丸酮、孕酮配制为10 000 mg/L的母液。将EPA培养基和浓缩离心后的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）（HB4培养基）配制为不同浓度梯度的试验溶液，小球藻浓度控制在约4×106 cells/mL，小球藻培养条件与杨家新等的培养条件[8]相同。

1.3 相关试验参数和计算方法

种群增长率：r=（lnNt-lnN0）/T（Nt为种群在t d时的种群数量，N0为起始数量，T为试验时间）。混交雌体与非混交雌体比：MF/AF=混交雌体数/非混交雌体数。携卵与非携卵比：OF/NOF=携卵/非携卵（ovigerous female/non-ovigerous）。混交百分率：MF=MF/（MF+MPF+AF）×100%（MF为混交雌体，AF为非混交雌体，MPF为产雄雌体）。受精百分率：受精百分率=产休眠卵/总混交雌体。受精率：受精率=携休眠卵雌体数/总雌体数。交配率：交配率=雄体相遇次数/（雄体相遇次数+成功交配次数）[9]。

1.4 种群动态学试验

取龄期小于4 h的轮虫幼体置于试管（直径1 cm、长度10 cm）中，4个/管，加入8 mL不同质量浓度的试验溶液（甲基睾丸酮质量浓度分别为0.1、1、10、100、1 000 μg/L，孕酮质量浓度分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L），每组设置5个平行组，另设1个空白组。每隔24 h振荡试管，使藻液分散均匀。于48 h时计数，并计算种群增长率和EC50值。于 96 h 时分别对非混交雌体、携雄卵雌体、携休眠卵雌体、非携卵雌体、休眠卵进行计数，类别鉴定方法与Paloheimo的方法[10]相同。7 d后对各质量浓度组试管底部的休眠卵进行计数并收集，风干后放入1 mL EPA Eppendorf离心管中，置于 4 ℃ 冰箱。30 d后取出该休眠卵置于6孔塑料培养板中孵化，置入30个/孔，加入5 mL EPA培养基，每组设置5个平行组，连续观察并计算孵化率。试验过程中不更换培养溶液。

1.5 受精率试验

对轮虫进行单克隆培养，从中挑取出8～9个2～4 h龄的非混交雌体以及刚产出的雄体，分别按照雌雄性比1 ∶ 2放入05 mL不同质量浓度的试验溶液中，于24孔板中培养。睾丸酮的质量浓度分别为1、5、25、125、625 μg/L，孕酮的质量浓度分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L。每组设3个平行组，另设1个空白对照组。试验开始24 h后移去雄体，之后每隔8 h移去携非混交卵的雌体、产雄卵的混交雌体，保留产休眠卵的雌体，并于试验进行72 h后统计携休眠卵的雌体数和总雌体数。试验过程中每隔12 h更换1次培养溶液。

1.6 受精行为观察

随机挑取龄期小于4 h的非混交雌体和刚产出的雄体，分别放入不同质量浓度的药物（睾丸酮、孕酮质量浓度同“15”节）中，不添加任何藻液。每组设5个平行组及1个对照组，置于96孔板中培养，反应体系控制在100 μL以内。在室温（23～25 ℃）下通过解剖镜连续观察20 min，根据Snell等的试验方法[5]记录雌体和雄体相遇次数及成功交配次数。

2 结果与分析

2.1 睾丸酮、孕酮对萼花臂尾轮虫2 d种群增长率的影响

由图1可知，睾丸酮、孕酮均对萼花臂尾轮虫的增长率具有显著影响（LSD，F=24.877，df组间=5，df组内=24，P

与对照组相比，3～4 mg/L孕酮组的种群增长率降低，4 mg/L 孕酮组的种群增长率下降了38.40%，差异显著（Dunnett检验，P<0.01）。Prohit分析得到孕酮的

EC50为4.3 mg/L。

2.2 睾丸酮、孕酮对萼花臂尾轮虫4 d种群动态学的影响

统计结果（表1、表2）表明，睾丸酮对萼花臂尾轮虫的MF/AF、混交率、7 d休眠卵产量、休眠卵/雌体比均具有极显著影响（LSD，F值分别为4.285、4.379、4.493、4.165，df组间均为5，df组内均为24，P均小于0.01），对受精率也具有显著影响（LSD，F=2.749，df组间=5，df组内=24，P005），孕酮对受精率的影响也不显著（F=0.177，df组间=5，df组内=24，P>0.05）。

2.3 睾丸酮和孕酮对萼花臂尾轮虫休眠卵孵化率的影响

由图2可知，睾丸酮和孕酮对萼花臂尾轮虫休眠卵的孵化率均具有极显著影响（F分别为7.28、31.28，df组间=5，df组内=24，P<0.05），呈先升高后降低的趋势。

2.4 睾丸酮、孕酮对萼花臂尾轮虫受精作用的影响

试验结果（图3）表明，睾丸酮对萼花臂尾轮虫混交雌体的受精率没有显著影响（LSD，F=2.21，df组间=5，df组内=138，P>0.05），而孕酮对轮虫受精率的影响极显著（LSD，F=379，df组间=5，df组内=90，P<0.01），大致呈抛物线形。

2.5 睾丸酮对萼花臂尾轮虫雄体交配行为的影响

由图4可知，在睾丸酮的影响下，雄体的交配行为差异极显著（LSD，F=6.93，df=24，P<0.05）。随着质量浓度的增加交配率明显降低，表明雄性激素可提高雄体交配率。

3 结论与讨论

3.1 睾丸酮、孕酮对萼花臂尾轮虫种群增长的影响

目前，关于外源雄性激素对萼花臂尾轮虫生殖影响的报道较少，多数集中于环境雌激素对轮虫生殖生理的影响。Radix 等研究发现，萼花臂尾轮虫的睾丸酮72 h-EC50为 26.3 μmol/L[11]，而本试验中得出的睾丸酮48 h-EC50约为511 μg/L，可能是由于不同品系的萼花臂尾轮虫存在一定差异。本试验中睾丸酮质量浓度为1～1 000 μg/L时，内禀增长率r大幅下降，与Radix等发现的r值在0.58 μmol/L睾丸酮刺激下发生下降[11]相似。Snell等研究表明，孕酮质量浓度低于10 mg/L时对臂尾轮虫Brachionus manjavacas种群增长无显著影响，高于14 mg/L时可对其产生抑制，而12 mg/L孕酮对海水种褶皱臂尾轮虫（B. plicatilis）无显著影响，表明高浓度环境激素对轮虫产生一定毒性效应[5]。本试验得到了相似结果，在2.0～2.5 mg/L时r值下降，可能是由于投喂食物的浓度和种类不同，对轮虫种群数量具有不同程度的影响。

3.2 睾丸酮和孕酮对萼花臂尾轮虫混交雌体的促进作用

本试验中，睾丸酮在EC50值附近对MF/AF和MF%值均具有显著影响，在0.1～100 μg/L范围内混交雌体比率上升，以r值为指标得出的EC50值与群体条件下得出的MF%、MF/AF 值具有一定的计量-效应关系，呈抛物线形；但对于 OF/NOF 值没有显著影响。可见，r值并不是判断睾丸酮对萼花臂尾轮虫生殖影响的理想指标，但该值仍是敏感的检测指标[12-14]。孕酮对混交雌体也有类似的促进作用，表明类固醇激素对轮虫内分泌产生干扰，刺激无性生殖向有性生殖转变，从而促发大量混交雌体的产生。

3.3 类固醇激素对萼花臂尾轮虫休眠卵生成和孵化的影响

Gallardo等在萼花臂尾轮虫的群体培养中发现，0.05、050 mg/L保幼激素（JH）刺激可将混交雌体发生率提高30%[15]。本研究表明，10、100 μg/L睾丸酮和2.0、2.5 mg/L孕酮可促进萼花臂尾轮虫休眠卵的产生。可能是由于在类固醇激素的作用下混交雌体大量出现，产雄雌体相对增加，药物对雄体、产雄雌体内分泌产生干扰，使雄体活力增强、受精率提高，进而影响卵雌比。

Snell发现孕酮对B. manjavacas休眠卵的孵化率具有明显影响，而对萼花臂尾轮虫无影响，本试验结果与之不一致，可能是由于休眠卵萌发也受到母体摄食类型的影响。在萼花臂尾轮虫对淡水水体中内分泌干扰物和重金属的研究中发现，轮虫在有性生殖阶段对环境刺激的反应比无性生殖阶段更敏感[16]。本研究结果显示，对于环境激素中的雌性激素（孕酮）和外源性的雄性激素（睾丸酮），休眠卵的孵化率是评价水体中内分泌干扰物的良好指标；加入此类性激素可在不破坏生态环境的基础上对萼花臂尾轮虫休眠卵的产生、孵化率的提升具有促进作用，在实际生产中具有一定利用价值。

3.4 环境激素对萼花臂尾轮虫有性生殖阶段中受精率和受精行为的影响

目前对轮虫交配行为的研究主要集中于萼花臂尾轮虫属[17-18]，而对于不同环境激素作用下轮虫受精作用的研究较少。本试验结果表明，在雌雄性比相同时，睾丸酮对轮虫混交雌体的受精率无显著影响，而一定质量浓度范围内的孕酮可显著提高受精率，促进轮虫交配行为的发生。Snell等研究发现，桡足类个体交配行为的发生依赖于水体中物种特异性接触的信息素类物质[19]，轮虫交配行为的发生与其类似。雄体通过头冠上的受体来获取雌体表面糖蛋白的化学信息，交配行为受到信号质量和强度的影响。本研究发现，睾丸酮在100 μg/L时显著提高轮虫的交配率，因此认为水体中性激素的存在干扰了自然的信息素，使雄体表现出不同程度的交配行为。雄体交配率的高低与最终混交雌体产生休眠卵的高低之间没有数量级关系，表明休眠卵的产生与交配次数无关，而可能与性激素对雌体内分泌系统的干扰有关。关于这种信息素类物质的结构、是否真实存在或被提取并无定论[20-22]，性激素的存在是否真正影响到此类物质，或直接对雄体的生理生化反应产生影响，有待借助分子生物学手段进一步研究。

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