不同给药途径伊立替康在家兔体内的药代动力学和生物利用度

缴万里 刘海洁 张熙杰 张桂荣 王玉红 曹德英 (唐山市工人医院药学部，河北 唐山 06000)

盐酸伊立替康 (Irinotecan Hydrochloride)是喜树碱类上市的新药之一，是用于转移性结、直肠癌一线治疗的化疗药，对氟尿嘧啶耐药病例仍有效〔1，2〕。目前市场上伊立替康仅有注射剂一种剂型，主要的不良反应为中性粒细胞减少症和腹泻，长期大剂量应用患者难以耐受。因为注射剂使用不方便，患者依从性差。而且伊立替康在临床使用时都必须佩戴眼镜、口罩、手套，给医务人员的操作带来很多困难。国外文献报道，动物口服伊立替康后有一定的生物利用度，提示伊立替康可以血管外给药。因此，为使患者用药更加方便、安全，本文试制了伊立替康中空栓，并以市售的注射用盐酸伊立替康为参比制剂，研究伊立替康中空栓在动物体内的药代动力学和绝对生物利用度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 美国Waters 2690高效液相色谱仪及474荧光检测器，Millennium32数据处理系统;Agilent TC-C18色谱柱;ZH-2型自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);TGL-16C型台式高速离心机(上海弗鲁克机电设备有限公司);800型台式离心机(上海手术器械厂);PHS-3C型台式精密pH计(上海雷磁仪器厂);分析天平(上海天平仪器厂);Gilson P型移液器(法国)。

1.1.2 试剂 盐酸伊立替康(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:616090901);注射用盐酸伊立替康(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:10032311);伊立替康中空栓(自制，每枚含伊立替康80 mg);甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸氢二钠、辛烷基磺酸钠、磷酸为分析纯;重蒸馏水(自制)。

1.1.3 动物 健康家兔(大耳白家兔，许可证编号:SCXK(京)2009-0014)，体重(2.5±0.3)kg，雌雄兼用，母兔无孕。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6×150 mm;5 μm);进 样 量 10 ～ 50 μl;流 动 相:0.05 mol/L Na2HPO4(pH3.0，内含 0.05 mol/L 辛烷基磺酸钠)-乙腈 =68∶32〔3〕;流速1.0 ml/min;检测波长:Ex 370 nm，Em 430 nm;柱温:室温。

1.2.2 样品处理 取含药血浆200 μl，加600 μl冷甲醇，涡旋混合30 s，离心，取上清液10～50 μl进样分析。

1.2.3 给药方法及血样采集 取健康家兔10只，随机分为两组，每组5只。第1组为静脉注射组;第2组为伊立替康中空栓直肠给药组。用药前，家兔禁食12 h，自由饮水，用药后6 h开始进食。静脉组于耳缘静脉注射盐酸伊立替康，给药剂量为60 mg/只〔4〕，分别于给药后 0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h耳缘静脉取血1.0 ml，加至预先加入肝素的塑料试管中，立即离心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分离得到血浆样品。直肠给药组由直肠给予伊立替康中空栓2枚，封闭肛门，给药剂量为 160 mg/只〔4〕，分别于给药后 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、48 h 耳缘静脉取血 1.0 ml，加至预先加入肝素的塑料试管中，立即离心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分离得到血浆样品。同上述“1.2.2”方法进行处理。

1.2.4 制备标准溶液 精密称量盐酸伊立替康标准品5 mg，用0.01 mol/L HCl溶液定容于25 ml量瓶中，得200 μg/ml的标准储备液。将其稀释配制成20 μg/ml的标准溶液备用。取1.9 ml空白血浆，加入100 μl盐酸伊立替康标准溶液，混匀，配成1 000 ng/ml的伊立替康标准含药血浆，再用空白血浆逐步稀释，配制成伊立替康浓度分别为 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml的系列标准含药血浆。

1.2.5 标准曲线的制备 取伊立替康系列浓度的标准含药血浆，按“1.2.2”方法处理后，进样10 ～50 μl，得到对应的峰面积，重复3次，以标准品系列浓度对应的峰面积(A)为纵坐标，其系列浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线A=bC+a。

1.2.6 回收率测定

1.2.6.1 提取回收率 按标准溶液的制备方法，取兔空白血浆，加入一定体积的盐酸伊立替康标准溶液，配制成浓度为80、400、800 ng/ml的血浆样品，按“1.2.2”方法处理，进样 50 μl，作高效液相色谱法(HPLC)分析，记录峰面积，与同浓度的盐酸伊立替康标准品溶液直接进样10～50 μl所测定的峰面积比较，计算提取回收率。

1.2.6.2 方法回收率 按标准溶液的制备方法，取兔空白血浆，加入一定体积的盐酸伊立替康标准溶液，配制成浓度为80、400、800 ng/ml的血浆样品，按“1.2.2”方法处理，进样10～50 μl，记录峰面积，由标准曲线计算出的浓度为伊立替康的测定浓度，伊立替康的测定浓度与实际浓度的比值为方法回收率。

1.2.7 精密度测定 每日每种浓度方法回收率各测定5次，计算日内精密度。连续测定5 d，计算日间精密度。

1.2.8 数据处理 两组动物的药代动力学参数按统计矩的非隔室动力学理论计算〔4〕，药-时曲线下面积(AUC)用梯形面积法计算，消除速率常数(Ke)由药-时曲线上末端4点求得，最大血药浓度(Cmax)和最大血药浓度对应时间(Tmax)采用实测值。以直肠给药组AUC(0-inf)比静脉注射组AUC(0-inf)，计算伊立替康中空栓的绝对生物利用度(F)，公式如下:

2 结果

2.1 HPLC色谱图 在选定条件下测得的色谱图见图1。结果显示，伊立替康的保留时间约为6.1 min。

2.2 标准曲线的绘制 以伊立替康标准品系列浓度对应的峰面积(A)为纵坐标，其系列浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线为A=215.08C－312.90(r=0.999 7，n=6)，结果表明，伊立替康血药浓度在25～1 000 ng/ml范围内线性关系良好 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml伊立替康对应的峰面积分别为 6 923、10 441、21 145、53 491、103 647、216 513。以信噪比为3，最低检测限10 ng/ml。见图2。

2.3 回收率测定 80、400、800 ng/ml三种浓度的提取回收率分别为(89.08±4.682)%、(90.23±3.668)%、(88.91±2.776)%，相对标准差为5.256%、4.030%、3.120%;方法回收率分别为(107.14±7.163)%、(96.76±5.658)%、(101.46±4.417)%，相对标准差分别为6.69%、5.85%、4.35%。

2.4 精密度测定 80、100、800 ng/ml三种浓度的日内精密度分别为 4.54% 〔(86.11±3.908)%〕、4.66% 〔(398.75±18.572)%〕、2.96%〔(815.69±24.167)%〕。日间精密度分别为 8.35% 〔(85.71 ±7.157)%〕、5.44% 〔(377.48 ±20.548)%〕、5.40%〔(809.58±43.677)%〕。

2.5 药代动力学分析 家兔静脉注射60 mg伊立替康和直肠给予160 mg伊立替康后，半衰期(T1/2)、表观分布容积(Vss)、消除速度常数(Ke)、机体总清除率(CL)、AUC(0-inf)、峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)见表1。家兔静脉注射伊立替康后的平均血药浓度-时间曲线见图3，家兔直肠给予伊立替康中空栓后的平均血药浓度-时间曲线见图4。伊立替康中空栓的平均绝对生物利用度为11.34%。

图1 HPLC色谱图

图2 血浆中伊立替康的标准曲线

图3 家兔注射伊立替康后平均血药浓度-时间曲线

表1 不同伊立替康给药方式主要药代动力学参数(± s，n=5)

表1 不同伊立替康给药方式主要药代动力学参数(± s，n=5)

参数 伊立替康注射液 伊立替康中空栓T1/2(h)15.599 9±6.479 4 22.505 2±7.282 4 Tmax(h) 1 4 Cmax(μg/ml) 17.853 3±0.906 8 3.065 3±0.178 6 Ke 0.050 1±0.020 9 0.033 4±0.010 7 Vss(ml/kg) 63.889 1±8.938 2 313.207 7±78.420 6 CL(ml·h－1·kg－1) 15.910 0 ±1.850 4 52.528 0 ±4.924 4 AUC(0-inf)(μg·h－1·ml－1)63.419 5 ±7.315 3 19.175 9 ±1.969 3 F(%)－11.34

图4 家兔直肠给药伊立替康中空栓剂后平均血药浓度-时间曲线

3 讨论

盐酸伊立替康目前已被广泛用于大肠癌、小细胞肺癌以及胃癌等实体瘤的治疗中，并经临床试验证实，其能够明显延长患者生存期，但血液学毒性和消化道反应严重限制了伊立替康的临床应用〔5〕。已有研究研究表明，盐酸伊立替康在动物和人体内的消除方式主要为肝代谢和胆汁分泌〔6〕。与其代谢相关的酶包括羧酸酯酶(CEs)、葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)、细胞色素P450(CYP3A)以及β-葡萄糖苷酸酶等。盐酸伊立替康在体内外易受羧酸酯酶的影响而转化为活性代谢产物10-羟基-7-乙基喜树碱(SN-38)，也能够通过CYP3A途径形成无活性的氧化产物。

1984 年日本学者渡道善照首次制备成中空栓剂，其外层为基质制成的壳，空心可填充固体、液体或混悬液状态的药物。为哮喘、糖尿病、贫血和癌症等慢性病的长期治疗提供了适合的剂型，能替代某些注射剂、灌肠剂，剂量准确，应用方便，缓释的中空栓可减少用药频率，增加病人的顺应性。

本研究结果表明，伊立替康静脉给药的Vss值比直肠给药的Vss值小很多，说明静脉给药的血药浓度要高于直肠给药的血药浓度;伊立替康注射剂在注射后约1 h出现反弹浓度，提示该药存在肝肠循环，而伊立替康中空栓在给药后6～8 h血药浓度基本不变，与大鼠口服伊立替康后的血药浓度相似〔4〕;伊立替康直肠给药后，有一定的生物利用度，提示直肠给药有可能成为伊立替康的另一给药途径。

然而，伊立替康在体内代谢为活性产物SN-38，由于没有SN-38的标准品，无法同时定量测定。另外，由于伊立替康中空栓含药量为80 mg/枚，每只家兔用两枚中空栓，直肠内基质较多，可能影响了伊立替康的吸收。因此，有待于通过进一步研究揭示伊立替康中空栓剂药代动力及生物利用度的特点。

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2 胡文蔚，王 赫，孙文辉.伊立替康联合氟尿嘧啶亚叶酸钙治疗转移性大肠癌31例临床观察〔J〕.中国癌症杂志，2008;18(1):77-8.

3 孙祥德，高 革，齐 伟，等.高效液相色谱法测定血浆中伊立替康的含量〔J〕.中国现代应用药学杂志，2005;22(1):57-9.

4 Bansal T，Awasthi A，Jaggi M，et al.Development and validation of reversed phase liquid chromatographic method utilizing ultraviolet detection for quantification of irinotecan(CPT-11)and its active metabolite，SN-38，in rat plasma and bile samples:application to pharmacokinetic studies〔J〕.Talanta，2008;76(5):1015-21.

5 王伟兰，朱 曼，郭代红，等.伊立替康临床应用的安全性研究〔J〕.中国药业，2011;20(3):41-2.

6 宋祥珍，曹 斌，张自强，等.伊立替康体内代谢途径及代谢产物的研究进展〔J〕.西北药学杂志，2009;24(6):515-7.