胆管癌组织中Ezrin蛋白表达水平及其临床价值

李绍军 刘小方 (青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院肝胆胰外科，山东 烟台 264000)

胆管癌或胆管细胞癌是起源于胆道上皮细胞的恶性肿瘤，发病率约占肝胆系统恶性肿瘤的15%〔1～3〕。寻找有效的肿瘤标志物不但可以早期诊断和对预后进行判断，也对寻找有效治疗靶点提供有益的参考。Ezrin蛋白是细胞骨架的主要成员，对肿瘤细胞的作用主要是参与控制细胞的形态、黏附、运动及为细胞的增殖和生存转换生长信号。近年来发现Ezrin蛋白的过表达与多种肿瘤侵袭与转移有关〔4～8〕，但在胆管癌中的系统研究尚未见报道。本研究探讨胆管癌Ezrin蛋白表达变化以及其与肿瘤分期、转移的关系，旨在探讨Ezrin蛋白在胆管癌发生、发展与转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 烟台毓璜顶医院肝胆外科2007年7月至2010年7月收治的有完整资料记载的胆管癌标本38例，排除二次手术，可供使用的标本30例;同时选取10例良性胆管疾病作为对照。所有标本资料详实，术前都未接受放疗与化疗。30例胆管癌标本中女12例，男18例;年龄37～74〔平均(57.2±14.7)〕岁;按照2002年美国癌症联合委员会(AJCC)公布的胆管癌分期方案，Ⅰ/Ⅱ期者11例，Ⅲ/Ⅳ期者19例;病理证实有淋巴结转移17例，无淋巴结转移13例。兔抗人Ezrin单克隆抗体:Bioworld公司;生物素-过氧化物酶复合物(SP)免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒:福州迈新生物技术有限公司。

1.2 方法 所有标本均术后立即取材，放入4%中性甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切取4 μm厚度切片1张，用于免疫组织化学染色，按SP免疫组化试剂盒说明书进行。

1.3 结果判定标准 染色细胞内出现棕色颗粒为阳性表达。Ezrin在癌组织中主要在胞质中表达。选取每张病理切片至少10个不同的视野在高倍镜下(250倍)观察，以此来判断细胞染色强度与着色率。染色结果半定量分析:以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分，组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞标志。染色强度以多数细胞呈现的染色特性(染色深浅需与背景着色相对比)计分:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野(每250倍视野计数100个此类细胞)的阳性细胞平均数:0～5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分。每张切片随机取5个250倍视野，每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分，染色强度与阳性细胞百分比的乘积:0分为阴性(－)，1～6分为弱阳性，7～12分为强阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件行χ2检验。

2 结果

2.1 Ezrin蛋白在胆管癌组织及良性胆管组织中的表达Ezrin蛋白在胆管癌组织及良性胆管组织中均有不同程度的表达，主要表达以细胞质和细胞膜为主，良性组织中，阳性表达率60.0%(弱阳性5例，强阳性1例)，评价得分3.1。胆管癌阳性表达率90%(弱阳性7例，强阳性20例)，平均得分6.96。经统计分析后发现，胆管癌组织中Ezrin蛋白的表达与良性胆管组织比较有显著性差异(P＜0.01)。见图1。

2.2 胆管癌中Ezrin蛋白的表达与临床病理特征的关系 Ⅰ/Ⅱ期11例胆管癌患者中阳性表达9例(82%，弱阳性5例，强阳性4例)，平均得分4.64;Ⅲ/Ⅳ期19例胆管癌患者中，阳性表达18例(95%，弱阳性2例，强阳性16例)，平均得分8.32，Ezrin蛋白在Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期胆管癌患者中的阳性表达强度有显著差异(P＜0.05)。17例伴淋巴结转移的患者Ezrin蛋白阳性表达率94%(弱阳性1例，强阳性15例)，评价得分9.11;没有转移的阳性表达率85%(弱阳性6例，强阳性5例)，平均得分4.09，经统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1 Ezrin蛋白在胆管癌中的表达

图2 Ezrin蛋白表达与临床分期及淋巴结转移的关系(×250)

3 讨论

在影响影响胆管癌预后几个因素中最关键是肿瘤的浸润与转移。胆管癌的侵袭、转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程，其中肿瘤细胞黏附能力及运动能力的改变，肿瘤细胞与细胞外基质间的相互作用是肿瘤发生侵袭转移的基础，也是肿瘤浸润转移的关键环节〔4，5〕。探讨影响这些关键环节的调控因素将有助于更深入地理解胆管癌浸润和转移的机制。

Ezrin蛋白是一种将细胞骨架与细胞膜连接起来的蛋白质，于1981年首次发现，是埃丝蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族的一员〔5，6〕。Ezrin蛋白表达具有相对的组织和细胞特异性，在正常组织主要集中在富含肌动蛋白的细胞表面，在维持细胞形态和生存方面起重要作用。研究发现Ezrin蛋白与肿瘤转移之间有密切联系:在乳腺浸润性导管癌中Ezrin蛋白表达水平也明显高于良性病变，而且与淋巴结转移正相关;伴有Ezrin蛋白过表达的卵巢癌细胞具有高转移潜能，而且预后差。通过siRNA对卵巢癌的Ezrin蛋白进行沉默可以显著降低肿瘤细胞的侵袭能力;Ezrin蛋白表达水平高的食管癌发生恶性转移的能力明显高于Ezrin蛋白表达水平低的肿瘤细胞，而且容易在内脏和软组织中形成肿瘤团块〔7～10〕。

在本研究中，胆管癌组织中的Ezrin蛋白表达明显高于正常胆管组织，说明在胆管癌的发病过程中，Ezrin蛋白发生了表达差异变化。在病理分期表达差异研究中，恶性程度高的Ⅲ/Ⅳ期胆管癌的表达明显高于Ⅰ/Ⅱ期的恶性程度比较低的胆管癌组织，而且发生转移的胆管癌组织的表达率明显高于尚未发生转移的胆管癌组织。说明Ezrin蛋白在胆管癌的恶性变和浸润转移过程中具有一定的作用。

本次研究结果说明Ezrin蛋白可作为检测胆管细胞癌程度、病理分期和预后的重要参考指标。但E-cadherin和Ezrin蛋白在胆管癌发生、恶变以及转移过程中，是直接作用于肿瘤细胞还是通过其他蛋白质进行作用以及其中的信号通路等研究尚未涉及，有待进一步研究。

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