载脂蛋白E拟肽对EAE小鼠的髓鞘和轴突损伤的影响

韦俊杰， 郑明华， 梁培霄， 陶 敏， 唐玉兰

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种累及中枢神经系统(central nervous system，CNS)的以髓鞘脱失为主伴轴突损伤为病理特征的自身免疫性疾病。缺乏ApoE会加重MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疾病进展和病理损伤［1］。ApoE拟肽是一种体外合成的小分子肽，保留了结合ApoE受体的主要结构域(133-149)，通过外周给药能穿过血脑屏障，模拟ApoE发挥生物学作用［2］。而ApoE拟肽治疗对EAE的MBP和NF-L的影响，国内外未见相关报道。

本研究通过对EAE小鼠进行ApoE拟肽干预，观察其临床症状和病理变化，并用免疫组化法检测MBP和NF-L的表达，研究ApoE拟肽对EAE的作用效果，探索多发性硬化治疗的新方法。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂 8～10w清洁级雌性的C57BL/6J小鼠40只，体重18～22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［动物许可证号SCXK(京)2009-0004］。COG112(序列 acetyl-YRQIKIWFQNRRMKWKKCLRVRLASHLRKLRKRLL-amide)由美国 Cognosci公司提供，纯度 ＞95%。MOG35-55(序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生工生物工程有限公司合成，纯度＞95%。百日咳毒素购自美国sigma公司;完全弗氏佐剂(CFA)购自加拿大bio basic公司;卡介苗购自北京生物制品研究所;兔抗MBP多克隆一抗、兔抗NF-L多克隆一抗均购自北京博奥森生物技术有限公司;SP法免疫组化试剂盒、DAB显色盒均购自北京中杉金桥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制模及干预 用0.01mol/L PBS缓冲液将少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)稀释成2mg/ml，与等量的含6mg/ml卡介苗的CFA充分混合，用全玻璃注射器抽打制成油包水乳剂抗原。随机将C57BL/6J小鼠分为正常组(n=10)、正常治疗组(n=10)、EAE 组(n=10)、EAE 治疗组(n=10)。EAE组、EAE治疗组于小鼠背部皮下多点注射MOG35-55乳剂抗原0.2ml/只。正常组、正常治疗组用生理盐水代替MOG35-55，余步骤和方法同前。免疫当天计为第0天，分别于第0、2天给每只小鼠腹腔注射百日咳毒素0.5μg/次。正常治疗组、EAE治疗组在免疫后第2天到第30天每隔两天按5mg/kg/day背部皮下注射COG112。正常组和EAE组除了用生理盐水替代COG112外，余给药方法相同。

1.2.2 症状及功能评分 免疫后第0～35天每日上午由同一个人观察小鼠症状并进行神经功能评分，同时测量体重并记录。神经功能评分采用15分评分法［3］。尾巴:0分为不发病;1分为尾巴张力减低;2分为尾巴全瘫。四肢按每个肢体单独评估:0分为无症状;1分为步态不稳;2分为肢体轻瘫;3分为肢体全瘫。将尾巴和每个肢体所得分数再累加得出总分，小鼠尾巴及四肢全瘫达到14分，出现死亡则评15分。

1.2.3 解剖及病理染色 免疫后第35天以10%的水合氯醛按体质量3m l/kg腹腔注射麻醉小鼠，先后经左心室灌注生理盐水和4%多聚甲醛，解剖分离大脑、脑干和脊髓，浸泡在4%多聚甲醛中4℃固定24h，然后逐级酒精脱水、石蜡包埋、切片、行HE染色。

1.2.4 免疫组化 将包埋好的石蜡组织块做4μm连续切片，余下按SP法免疫组化试剂盒说明书操作。阳性表达为细胞膜或细胞质染成黄色或棕黄色，阴性对照用PBS代替一抗，余步骤相同。每只小鼠的大脑、脑干和脊髓各取3张切片，每张切片在显微镜下选取互不重复的5个视野(×400倍)，采用Image-proplus6.0软件对图像进行分析，测定每个视野的积分光密度值(IOD)和阳性面积(area)，计算平均积分光密度(IOD/area)。

2 结果

2.1 发病情况 EAE组、EAE治疗组的小鼠全部发病，但各有1只小鼠发病后死亡。两组小鼠均在免疫第10天后开始陆续发病，症状随时间的延长而逐渐加重，高峰期后有一定的缓解。两组比较潜伏期、峰值评分均无统计学意义(P＞0.05)，而慢性期(第35天)评分、累积临床评分EAE治疗组均优于EAE组(P＜0.05)(见表1)。

2.2 HE染色结果 EAE小鼠大脑、脑干和脊髓均有不同程度的炎性细胞浸润，部分小血管周围的炎性细胞浸润呈袖套样改变。EAE治疗组小鼠炎性细胞浸润明显轻于EAE组，浸润以脑干和脊髓为明显，大脑较少见。正常组和正常治疗组均未见异常(见图1)。

2.3 各组MBP的表达比较 通过免疫组化测定各组织MBP的平均积分光密度发现，正常组和正常治疗组相比无明显差异(P＞0.05)，EAE组的大脑、中脑和EAE治疗组的各部位均低于正常组和正常治疗组(P＜0.05)，EAE治疗组的中脑和脊髓均高于 EAE 组(P ＜0.05)(见表2、图2)。

2.4 各组NF-L的表达比较 通过免疫组化测定各组织NF-L的平均积分光密度发现，正常组和正常治疗组相比无明显差异(P＞0.05)，而EAE组的大脑、脊髓和EAE治疗组的各部位均低于正常组和正常治疗组(P＜0.05)，EAE治疗组的中脑和脊髓均高于EAE组(P＜0.05)(见表3、图3)。

表1 临床症状观察(±s)

表1 临床症状观察(±s)

与EAE组比较*P＜0.05

组别 潜伏期(d)峰值评分 慢性期评分 累积临床评分EAE组EAE治疗组13.20 ±2.04 13.40 ±2.68 7.80 ±3.49 4.90 ±3.96 4.33 ±2.29 1.67 ±1.11*97.89 ±36.81 56.33 ±37.83*

表2 MBP在实验小鼠CNS中的表达(±s)

表2 MBP在实验小鼠CNS中的表达(±s)

与EAE组比较*P＜0.05;与正常组比较#P＜0.05;与正常治疗组比较△P＜0.05

组别平均光密度值大脑 中脑 脊髓EAE组EAE治疗组正常组正常治疗组0.1060 ±0.0119#△0.1199 ±0.0102#△0.1514 ±0.0189 0.1459 ±0.0286 0.0949 ±0.0221#△0.1214 ±0.0161*#△0.1455 ±0.0311 0.1543 ±0.0299 0.1011 ±0.0155#△0.1207 ±0.0201*0.1362 ±0.0324 0.1480 ±0.0139

表3 NF-L在实验小鼠CNS中的表达(±s)

表3 NF-L在实验小鼠CNS中的表达(±s)

与EAE组比较*P＜0.05;与正常组比较#P＜0.05;与正常治疗组比较△P＜0.05

组别平均光密度值大脑 中脑 脊髓EAE组EAE治疗组正常组正常治疗组0.1381 ±0.0221#△0.1419 ±0.0205#△0.1755 ±0.0364 0.1822 ±0.0434 0.1389 ±0.0293#△0.1562 ±0.0255*0.1625 ±0.0397 0.1645 ±0.0230 0.1400 ±0.0197#△0.1605 ±0.0467*#△0.1768 ±0.0374 0.1765 ±0.0455

3 讨论

在CNS内，神经轴突生长和髓鞘合成所必需的脂质主要依靠ApoE来转运。此外ApoE还能发挥清除代谢产物、维护血脑屏障、减少毒性损伤、调节免疫功能等作用。但完整的ApoE分子量大，正常状态下不能通过血脑屏障，限制了其作为外源性药物的应用。COG112作为一种近年来研制出的ApoE拟肽，在保留结合ApoE受体的主要结构域(133-149)的同时还融合了果蝇触角蛋白的转导区域，更容易通过血脑屏障发挥作用［4］。

本次实验发现，EAE组的慢性期评分、累积临床评分均高于EAE治疗组，说明 COG112的干预可减缓EAE病情进展。虽然EAE组的峰值评分高于EAE治疗组，但是P=0.099没有统计学意义，这可能是由于两组均有一只小鼠因死亡评了15分，计入该评分导致两组该统计学差距的缩短。如果两组峰值评分均不纳入死亡小鼠，则峰值评分差异(7.00±2.55 对3.78 ±1.86，P=0.007 ＜0.05) 有统计学意义。

本实验将MOG35-55制成乳化抗原免疫C57BL/6J小鼠成功诱发了EAE模型，该模型具有病程慢性进展、炎性反应轻、脱髓鞘和轴突损伤明显等特点［5］，适用于研究药物对EAE髓鞘脱失和轴突损伤的影响。MBP作为CNS髓鞘的主要蛋白质，是反应髓鞘脱失情况的高特异性的指标。作为神经丝成分之一的NF-L被认为是MS患者脑脊液中特异性较高的轴突损伤指标［6］。EAE治疗组的 MBP和NF-L的表达比EAE组有所提高，说明COG112的干预能减轻EAE的髓鞘脱失和轴突损伤。在本实验中EAE治疗组的炎性细胞浸润较EAE组减少，与国际上报道COG112能改善EAE的病情并减少淋巴细胞浸润的研究结果［4］相符合，但该报道中未用到免疫组化检测MBP和NF-L来观察髓鞘脱失和轴突损伤情况，而本实验正好完善了该方面的研究。

目前认为COG112通过以下机制发挥对EAE的保护作用:一个方面，COG112能促进损伤的髓鞘和轴突的修复。COG112保留有ApoE的受体结合域，该结合域能结合低密度脂蛋白受体(LDLR)和LDLR相关蛋白1(LRP1)［7］，结合少突胶质细胞的 LRP1能使鞘磷脂更容易被细胞摄取［8］，结合神经元的LRP1能抑制神经元的凋亡［9］。另一个方面，COG112能减少损伤髓鞘和轴突的不利因素。首先，COG112的结合域能抑制小胶质细胞和巨噬细胞的激活，阻止其炎性信号的传导，并减少其TNF-α、IL-6的分泌［10，11］。其次，在动物体内试验发现 COG112能抑制CD4+T淋巴细胞的增殖，同时还降低巨噬细胞的TNF-α、IL-6、一氧化氮(NO)、NO 合成酶的表达［4］。再者，COG112结合域能部分性竞争结合N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)的受体［12］，NMDA 受体是与神经毒性氨基酸如谷氨酸等结合的受体之一。而EAE中已激活的免疫细胞会释放大量的谷氨酸，高浓度的谷氨酸能直接对神经细胞产生兴奋毒性，导致细胞损伤和凋亡。COG112能通过竞争性结合NMDA受体从而发挥拮抗谷氨酸的神经毒性作用，在EAE的神经毒性损伤中起到神经保护作用。

本研究发现COG112能改善EAE模型的临床症状，减轻髓鞘和轴突的损伤，促进髓鞘修复和轴突的再生，对EAE起到了治疗作用，可能为MS临床治疗提供新的方法。但由于MS对髓鞘和轴突的损伤机制复杂，还需要与淋巴细胞和炎性因子的变化结合起来研究EAE模型中ApoE拟肽的作用机制，并根据研究成果来改进ApoE拟肽的用法，以期达到最优疗效。

图1 A:EAE组;B:EAE治疗组;C:正常组;D:正常治疗组(HE染色，×400)

图2 E:EAE组;F:EAE治疗组;G:正常组;H:正常治疗组(MBP免疫组化染色，×400)

图3 I:EAE组;J:EAE治疗组;K:正常组;L:正常治疗组(NF-L免疫组化染色，×400)

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