阿尔茨海默病患者血浆NO、ox-LDL 3-NT的临床研究

彭 誉， 赵 中

阿尔茨海默病(Alzheimer’disease，AD)是一种常见的中枢神经退行性疾病，其发病率呈逐年增高趋势，严重威胁人民的生活健康。研究显示，氧化应激与硝化应激与痴呆的发病密切相关，氧化应激与硝化应激产物，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、3-硝基络氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)广泛存在于神经退行性疾病中［1］。另外，AD患者神经元的缺失与氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)有密切关系［2］。本实验旨在研究AD患者血浆NO、ox-LDL和3-NT水平并作相关性分析，从而了解其在AD发病过程中的作用及其可能的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料 于2011年1月～2012年3月入住我院神经内科治疗的AD患者中随机抽取48例为研究对象，AD诊断参照美国精神医学会的《精神障碍诊断的统计手册》即 DSM-Ⅳ-R诊断标准［3］:(1)认知功能障碍:A.记忆力障碍(包括近的和远的记忆力障碍);B.认知功能损害至少具备下列一项，即失语、失用、失认、抽象思维和判断力损害。(2)上述两种认知功能障碍明显干扰了职业和社会活动或与个人以往相比明显减退。(3)不只是发生在谵妄病程之中。(4)上述损害不能用其他的精神及情感性疾病解释。(5)所有患者经完整的神经系统体检无局灶阳性体征。同时收集健康受试者37例(NC组)，所有受试者均符合:(1)简明精神状态量表(MMSE)评分正常(＞24分);(2)性别、年龄、教育程度、血液相关生物学指标相匹配的健康体检人员。所有研究对象均获知情同意。两组研究对象基本情况(见表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 神经心理量表的测定 (1)简易精神状态检查量表(Mini Mental State Examination，MMSE):对两组的智能损害进行筛选，根据文盲、小学、中学、大学等不同的文化程度，分别以MMSE评分≤17、20、22、23分为入选AD组标准。(2)日常生活能力量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)共20项，用于辅助评估病情轻重程度。评分标准为4级:1分代表自己可以做;2分为有些困难;3分为需要帮助;4分为根本没法做。(3)Hachinski缺血指数(Hachinski Ischemic Scale，HIS)共13项，用于鉴别AD与VD。评分越高越支持VD:≥7分支持VD诊断;≤4分支持AD诊断。(4)痴呆严重程度根据全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)分级。GDS评分:3、4分者为轻度组。5分为中度组;6、7分为重度组。

1.2.2 血液标本的采集和测定 患者入组后，于清晨抽取空腹静脉血2ml，肝素抗凝，1500r/min离心10min，完全分离血浆，保存于-80℃冰箱待测。采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)NO试剂盒(adlitteram diagnostic laboratories，美国)、抗人 3-NT ELISA试剂盒(adlitteram diagnostic laboratories，美国)、抗人ox-LDL ELISA试剂盒(adlitteram diagnostic laboratories，美国)测定血浆 NO、3-NT、ox-LDL浓度。检测方法严格按照实验设计步骤。AD组和NC组的血糖、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、总蛋白、白蛋白等基本生化指标均经我院检验科检测(见表1)。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，样本间男女构成比较采用χ2检验;其它临床特点及指标均数比较采用t检验;相关性分析应用Pearson相关分析，检验水准设α=0.05。

2 结果

2.1 两组基本情况(见表1)。NC组和AD组的性别构成、年龄、受教育年限、基本生物学指标比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。MMSE、ADL、HIS、GDS评分(见表2)。NC组MMSE、ADL评分与AD组比较，差异有统计学意义(均 P=0.000)。HIS、GDS评分仅作PD确诊及严重程度评价。依据GDS评分AD组患者分为3亚组:轻度AD组(11例)、中度AD组(20例)、重度AD组(17例)。

2.2 血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度测定结果两组血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度测定结果见(见表3)。t检验结果显示，AD组血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度分别高于NC组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 不同程度AD患者血浆NO、ox-LDL和3-NT浓度的比较以及等级相关分析 各AD亚组及NC组血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度(见表4)。方差分析显示各AD亚组及NC组患者血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度有差异;进一步的多重分析(SNK法)显示轻、中、重度AD组的血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度显著高于NC组。不同严重程度AD组患者之间血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度随着病情加重而升高，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。将NC组及AD组患者分成4个等级:以NC为0级、轻度AD为1级、中度AD为2级、重度AD为3级。分析血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度与AD严重程度之间的相关关系(Spearman相关分析法)，结果显示血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度与AD的严重程度呈正相关，即随着痴呆严重程度的增加，血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度呈上升趋势(见表5)。

2.4 血浆NO、3-NT和 ox-LDL浓度 AD MMSE评分线性相关分析 轻度AD组MMSE评分(17.2±5.8)分;中度 AD组患者 MMSE评分(13.3±5.6)分;重度 AD 组患者 MMSE 评分(11.4±6.2)分。Spearman相关分析结果显示血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度与MMSE评分存在负相关性(P＜0.05)，即随着MMSE评分的减少，血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度呈上升趋势(见表6)。

2.5 AD 组内 NO、3-NT、ox-LDL 浓度之间的线性相关分析 Pearson相关分析显示:AD组中血浆NO浓度与3-NT浓度呈正相关，即随着血浆NO浓度的增高，血浆3-NT浓度升高，而血浆NO、3-NT浓度与血浆ox-LDL浓度之间不存在相关关系(见表7)。

表1 NC组、AD组基本情况比较(±s)

表1 NC组、AD组基本情况比较(±s)

两组间比较*P＞0.05

项目 NC组(n=37) AD组(n=48) χ2值 P值年龄(岁)受教育程度(年)吸烟［n(%)］血糖(mg/dl)总胆固醇(mg/dl)高密度脂蛋白(mg/dl)低密度脂蛋白(mg/dl)三酰甘油(mg/dl)总蛋白(g/dl)白蛋白(g/dl)尿酸(mg/dl)肌酐(mg/dl)谷丙转氨酶(U/L)谷草转氨酶(U/L)乳酸脱氢酶(U/L)维生素B12(pg/ml)叶酸(ng/ml)游离甲状腺素4(ng/dl)促甲状腺素(m IU/ml)C-反应蛋白(mg/dl)胰岛素(mU/ml)血红蛋白(g/dl)71.06 ±5.87 7.89 ±5.65 18(50.1%)101.1 ±10.3 213.6 ±48.9 57.8 ±14.6 136.8 ±16.4 89.4 ±36.8 7.57 ±0.26 3.91 ±0.18 32.8 ±18.2 1.10 ±0.17 21.6 ±4.4 20.1 ±6.9 173.5 ±45.6 9.5 ±5.3 13.5 ±4.5 1.07 ±0.18 1.18 ±0.54 2.75 ±1.63 8.91 ±2.94 11.2 ±1.9 69.32 ±5.53 6.37 ±6.58 24(44.3%)94.5 ±10.2 204.5 ±20.3 45.9 ±10.3 138.2 ±34.7 125.2 ±45.8 7.50 ±0.43 3.86 ±0.22 38.8 ±13.1 0.98 ±0.27 20.3 ±4.3 15.9 ±7.2 209.6 ±66.7 8.6 ±3.9 10.2 ±4.3 0.99 ±0.23 1.04 ±0.25 2.59 ±1.97 10.2 ±3.34 9.9 ±1.5 1.181 0.234 0.82 2.132 2.452 0.986 1.221 0.847 0.112 0.213 0.544 0.099 0.432 0.256 2.001 0.101 0.223 0.113 0.167 0.184 0.256 0.302 0.243*0.672*0.347*0.164*0.062*0.453*0.178*0.321*0.2341 0.1741 0.1391 0.0821 0.1531 0.2611 0.4211 0.1311 0.1461 0.0981 0.1031 0.2071 0.3861 0.2351

表2 NC组与 AD 组 MMSE、ADL、HIS、GDS评分比较(±s)

表2 NC组与 AD 组 MMSE、ADL、HIS、GDS评分比较(±s)

两组间比较*P＜0.05;*仅用来评价AD患者病情轻重和分级

项目 NC组(n=37) AD组(n=48) χ2值 P值MMSE评分ADL评分HIS评分*GDS评分*27.2 ±1.01 13.25 ±2.30--14.2 ±5.33 20.82 ±4.31 1.32 ±1.52 6.35 ±4.62 11.32 10.75--0.000*0.000*--

表3 NC组和AD组血浆NO、ox-LDL及3-NT浓度比较(±s)

表3 NC组和AD组血浆NO、ox-LDL及3-NT浓度比较(±s)

项目 AD组 NC组 P值NO浓度(μmol/L)3-NT浓度(nmol/L)ox-LDL浓度(μg/L)41.01 ±16.40 119.46 ±21.82 112.25 ±17.81 15.97 ±6.63 55.09 ±9.63 47.46 ±10.04 0.000 0.000 0.000

表4 不同程度AD患者及NC组血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度的比较(±s)

表4 不同程度AD患者及NC组血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度的比较(±s)

与NC组比较*P＜0.05

组别 NO浓度(μmol/L) 3-NT浓度(nmol/L) ox-LDL浓度(μg/L)NC组(n=37)轻度AD组(n=11)中度AD组(n=20)重度AD组(n=17)FP 15.97 ±6.63 25.82 ±5.331*35.34 ±13.461*57.26 ±7.841*87.962 0 55.09 ±9.63 106.47 ±5.851*114.52 ±14.651*133.82.±27.471*124.365 0 47.46 ±10.04 101.51 ±4.791 107.64 ±14.931*126.02 ±18.261*186.33 0

表5 血浆NO、3-NT、ox-LDL与AD的严重程度之间的Spearman相关分析(n=48)

表6 AD患者血浆NO、3-NT、ox-LDL浓度MMSE得分之间的Spearman相关分析(n=48)

表7 AD组内血浆NO、3-NT、ox-LDL浓度之间的线性相关分析r值(Spearman相关分析)

3 讨论

硝化应激即蛋白质的硝化作用，是指由NO或由NO衍生的活性氮族(reactive nitrogen species，RNS)与活性氧族(reactive oxygen species，ROS)共同联合发生的生物化学作用［4］，使细胞内蛋白质中的酪氨酸硝化成3-NT，引起细胞损伤或凋亡，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。硝化应激的标志物主要为 RNS，RNS指的是 NO、亚硝酸(nitrous acid，HNO2)、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anion，ONOO-)、二氧化氮(nitrogen dioxide，NO2)等，3-NT的形成被认为是体内RNS形成的生物标志［1］。RNS的形成离不开ROS，氧化应激状态下RNS/ROS水平的升高将导致蛋白质的硝化。硝化应激与氧化应激密切相关的、活性氮及活性氧联合反应引起的蛋白质翻译后修饰，且与氧化应激密切相关的活性氧如超氧阴离子(superoxide anion，O2-)、羟自由基(hydroxyl free radical，·OH)、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)、NO等与活性氮的生成和清除途径相交叠并互相调节［5］。当体内发生氧化应激时，产生大量的NO和活性氧。一方面NO和O2-反应生成过氧亚硝酸根离子ONOO-，它既可以作为硝化剂，又可以作为强氧化剂，与蛋白质、脂质、核酸等生物大分子反应;另一方面NO的氧化产物亚硝酸盐与H2O2共存时，在过氧化物酶的催化下，也能作为硝化剂和氧化剂损伤蛋白质及核酸。因此，蛋白质硝化和氧化应激作用能影响蛋白质的2、3、4级结构，进而影响细胞的信号传导、细胞骨架、酶催化作用，产生炎症反应，影响细胞的生存，参与 AD的发病［6］。

本实验显示AD患者血浆NO、3-NT浓度显著高于正常对照组(P＜0.05和 P＞0.05)，这与国外一些文献报道的结果一致［7，8］，Sinem［7］等对 15 例未接受任何治疗的AD患者和对62例接受抗胆碱之酯酶抑制剂和抗精神失常药物治疗研究发现，未接受治疗AD患者血浆NO、3-NT显著增高，短期接受抗胆碱酯酶抑制剂治疗的患者血浆NO浓度较长期接受抗胆碱酯酶抑制剂显著降低。这与AD患者氧化应激导致iNOS量和活性的增加，进而导致血浆NO浓度的升高，而过多的 NO 可进一步生成3-NT［7，9］。但一些研究显示［10，11］，AD 患者血浆 NO、3-NT 浓度未显著发生变化，甚至是降低，其可能的原因有:所取标本时间过长，由eNOS、nNOS催化生成的NO半衰期仅数秒，而由iNOS产生的NO半衰期也就数小时，测量时NO已经代谢分解，产生3-NT原料减少，同时抗胆碱酯酶抑制剂的治疗也能影响结果［10］。本研究还发现AD患者血浆NO、3-NT浓度与MMSE评分成负相关，即AD患者血浆NO、3-NT浓度越高，MMSE评分越低，提示血浆NO、3-NT浓度可以反映AD患者认知功能损害程度，而且血浆NO浓度与3-NT浓度呈正相关。推测其机制可能为:(1)阿尔茨海默病的发病机制与氧化应激密切相关，当机体受到感染、疾病或环境等的影响时，机体氧化水平超过抗氧化水平、活性氧簇和活性氮簇等高活性的分子就会大量堆积，而高浓度的NO参与β淀粉样蛋白(amyloidβprotein，Aβ)的神经毒性作用，导致AD的产生［12］。(2)研究显示，AD患者存在明显的内颞叶结构病变，包括海马结构、杏仁核和海马旁回，而这些位置的糖代谢效率较高，对氧的需求最高，线粒体氧化磷酸化的同时能产生大量的氧自由基和氮自由基，而上述结构清除自由基和抗氧化能力较差，而这些部位是脑认知功能重要的结构基础，其损害程度与认知功能下降幅度相关［13］。当各种危险因素导致上述部位损害时，损害愈重，认知功能下降愈明显，NO、3-NT升高也越显著。

脑内胆固醇主要以非酯化形式存在于髓鞘、星形胶质及神经细胞膜，主要参与髓鞘的构成。现阶段普遍认为胆固醇在脑内自体合成，脑外胆固醇对脑组织胆固醇含量无明显影响，而脑组织多余的胆固醇会转移到外周?研究显示，脑组织胆固醇含量改变会影响淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)和 Aβ 的表达量，参与 AD 的发病［14］。研究显示，神经退行性病变，尤其AD患者脑组织胆固醇转移增加，但完整的血脑屏障会限制胆固醇从脑组织到周围血液循环的直接运输.胆固醇需要依靠相关脂蛋白作为载体才能转出脑组织，尤其是主要分布于脑组织和脉络膜周围的低密度脂蛋白(LDL)能通过血脑屏障［14］。在AD中，变性的神经元和突触释放胆固醇含量增加，而脂质蛋白更对氧化应激和神经毒性更加敏感，形成稳定的氧化脂蛋白［15］。本研究显示，AD患者血浆ox-LDL浓度显著高于正常对照组(P＜0.05)，同时AD患者血浆ox-LDL浓度与MMSE评分成负相关，可能与AD患者脑组织胆固醇转移增加，低密度脂蛋白含量增加，在氧化应激和硝化应激环境下，低密度脂蛋白更易被氧化，导致含量增加［14］。Konukoglu［16］等对 30 例 AD 患者、20例血管性痴呆患者以及15例认知功能正常患者研究发现，AD患者血浆ox-LDL浓度较两对照组显著升高，而Zafrilla［17］等的研究发现，轻中度AD患者血浆ox-LDL浓度，而重度AD患者变化不明显，而Sinem［7］等在2010年的研究结果同样支持本结论?本实验显示AD患者血浆NO、3-NT浓度分别与血浆ox-LDL浓度之间不存在相关关系原因还有待于进一步研究，可能与三者参与AD起病机制不同有关?但Konukoglu［16］等研究AD患者血浆ox-LDL与血浆NO存在正相关，而与3-NT无关，而Sinem［7］等研究发现AD患者血浆NO水平与3-NT、ox-LDL存在正相关性，这可能与ox-LDL能增加氧化活性物质的形成，促进星形胶质细胞、小胶质细胞的增值、分化以及炎性因子的形成，进而加剧氧化应激和硝化应激有关［18］。

总之，NO、3-NT和ox-LDL在氧化应激和硝化应激过程中起着重要作用，作为AD发病过程的重要因素，与AD患者的病情严重程度密切相关，血浆NO、3-NT和ox-LDL浓度的测定有可能作为诊断AD的手段之一，对AD的诊断可能有着一定的意义。

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