脊髓缺血再灌注损伤模型的改进及对大鼠神经行为学的影响

金 华， 郭光琼， 李 江， 肖高鹏， 赵 强， 李艳华

临床较为常见的胸、腹主动脉瘤、脊柱骨折、脊髓供血动脉疾患、脊髓内显微外科手术、骶管肿瘤手术等常导致脊髓缺血损伤(spinal cord Ischemia injury，SCII)，引起急性或迟发性截瘫的发生，严重影响患者生活质量。建立标准可靠的动物模型对了解脊髓缺血再灌注损伤的病理生理机制，并进一步研究脊髓保护和治疗方案至关重要。目前通过结扎主动脉模拟临床脊髓血供障碍的模型多数在兔、狗、猪等较大型动物实现，而对大鼠施行上述手术存在操作难度大、可重复性差等问题。本实验对传统脊髓缺血损伤模型进行改进，对大鼠肾下腹主动脉结扎同时切断肾上腹主动脉发出的椎动脉以确保腰段脊髓血供被完全阻断。此外，经股动脉置入导管既可以检测阻断部位以下血压，又能成为局部注射药物或生物制剂治疗脊髓缺血的途径。本研究建立SCII改良动物模型并研究其对大鼠神经行为学的影响，为进一步研究脊髓缺血损伤的病理机制和治疗方案提供方法学基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 清洁级健康成年雌性SD大鼠56只，体重(220±10)g，随机分为7组，每组8只。假手术(A)组仅行单纯手术操作但不结扎腹主动脉;对照1(B)组行肾下腹主动脉结扎术60min后开放腹主动脉实现脊髓再灌注;对照2(C)组结扎肾下腹主动脉90min后再灌注;对照3(D)组结扎肾下腹主动脉120min后再灌注;改良1(E)组行肾下腹主动脉结扎术并切断肾上腹主动脉发出的椎动脉，阻断血供60min后开放腹主动脉再灌注。改良2(F)组行肾下腹主动脉结扎术和椎动脉切断术，阻断血供90min后再灌注;改良3(G)组行肾下腹主动脉结扎术和椎动脉切断术，阻断血供120min后再灌注。实验动物由昆明医学院实验动物科提供［实验动物质量合格证号:SYXK(滇)2005-0004］。

清洁级健康成年雌性SD大鼠56只，体重(220±10)g，随机分为7组，每组8只。假手术(A)组仅行单纯手术操作但不结扎腹主动脉;对照(B、C、D)组行肾下腹主动脉结扎术，分别阻断腹主动脉60min、90min、120min 后开放，脊髓再灌注;改良(E、F、G)组切断肾上腹主动脉发出的椎动脉后结扎肾下腹主动脉，分别阻断血供60min、90min、120min后开放腹主动脉再灌注。实验动物由昆明医学院实验动物科提供［实验动物质量合格证号:SYXK(滇)2005-0004］。

1.2 缺血再灌注模型的建立和改进

1.2.1 麻醉与检测 以3.6%的水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉动物，左侧后肢根部去毛消毒，剪开皮肤，暴露左侧股动脉，明视下行股动脉穿刺置入24号动脉套管针，接压力传感器，以飞利浦M8003A型监护仪(德国)监测股动脉平均压(MAP)和脉率(PR)。将温度探头插入大鼠肛门持续监测肛温(Tr)，以灯泡维持大鼠肛温于37℃ ～38℃。分别记录各组腹主动脉阻断前(基础值)、阻断10min、再灌注10min时的上述指标。术中视大鼠体动和呼吸情况半量追加水合氯醛以维持麻醉效果。

1.2.2 动物模型制作 取右侧卧位固定大鼠，纵行切开左侧腹部皮肤2～3cm，钝性分离皮下组织，暴露后腹膜。游离左肾动脉及其上、下各约1.5 cm长的腹主动脉，注意保护淋巴管。以双极电凝(威利FxTM-8C型电刀，美国)切断左肾上动脉分支以上腹主动脉向脊髓发出的椎动脉，随后于左肾动脉开口下方以4号丝线结扎腹主动脉，阻断血供。阻断时，以股动脉压力波形消失，MAP≤10mmHg(1.33kPa)为标准;开放时，以股动脉压力波形恢复为标准。动脉结扎前经股动脉推注肝素20U预防血栓形成。术毕认真检查手术部位没有渗血后逐层缝合。术后所有大鼠每天腹腔注射青霉素(20万U)预防感染，对于术后截瘫的动物，每天早晚各一次按摩膀胱排尿，必要时给予开塞露排便。

1.2.3 标本采集和处理 术后48h对实验动物取材，所有大鼠麻醉后仰卧固定，开胸左心室插管至主动脉弓，右心耳剪一小口，生理盐水灌注至清亮液体流出后将大鼠俯卧固定，切开背部皮肤和脊柱两侧肌肉，咬骨钳咬开椎板，充分暴露脊髓，取出整个脊髓。截取L2节段脊髓置于4%多聚甲醛内作后固定，再将标本分别置于15%和30%梯度蔗糖液内脱水。使用恒冷式切片机(Leica公司)连续冰冻切片，片厚20μm，贴片后37℃烤干备用。

1.3 模型评价指标

1.3.1 神经行为学评价 采用Basso［1］等提出的BBB评分体系于术后12h、24h和48h对所有大鼠进行行为学评估，包括0～21级，完全功能缺失为0分，完全正常鼠为21分，评价的内容主要包括大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙以及尾的位置等。评分者为3位熟悉评分标准的非本组实验人员，评分后取平均值。

1.3.2 NeuN免疫组织化学染色及脊髓前角正常神经元计数 采用PV-9000两步法进行免疫组织化学染色:0.01mol PBS冲洗切片5min×3次;3%H2O2去离子水浸泡10min，蒸馏水冲洗5min×2次;0.01mol PBS冲洗5min×3 次，甩去 PBS，5%羊血清封闭液室温下孵育30min;在切片上滴加兔抗大鼠NeuN(1∶200，Chimecon，美国)，阴性对照以0.01 mol PBS替代一抗，4℃过夜;次日0.01mol PBS冲洗5min×3次，切片上滴加适量试剂1(PV-9000试剂盒)，室温下孵育30min;0.01mol PBS冲洗5min×3次，甩去PBS，切片上滴加适量试剂2(PV-9000试剂盒)，室温下孵育30min;0.01mol PBS冲洗5min×5次，甩去PBS，切片上滴加一滴新鲜配制的DAB显色液，室温下显色3～5min，切片放入蒸馏水中终止显色;将切片置入苏木素染液中复染1min，自来水洗去玻片上多余杂液，返蓝液返蓝30s;常规脱水、透明，中性树胶封固;采用 leica application V 3.3.0数码成像系统对切片进行图像采集，观察脊髓组织病理学改变，并计数第Ⅷ、Ⅸ板层正常神经元(正常神经元定义标准［2，3］:细胞呈多角形，胞浆染为红色，内有正常的尼氏体;胞核居中，呈圆形，轮廓清晰，核仁明显;胞体直径30～60μm。同时满足以上标准者为正常神经元)。

2 结果

2.1 生理指标 各组间MAP、PR、Tr基础值差异均无统计学意义(P＞0.05);与本组基础值比较，B、C、D、E、F、G 组 MAP 于阻断 10min 时显著降低(P＜0.01)，再灌注10min时明显回升(与同组阻断10min比较，P ＜0.01)但仍低于基础值(P ＜0.01);各组PR和Tr于各时点变化差异无统计学意义(P＞0.05)(见表1)。

2.2 神经行为学评分(BBB评分) 与A组比较，各组行腹主动脉阻断术大鼠BBB评分于术后12h、24h、48h 均显著降低(P ＜0.01)，其中以12h 时降低最为显著，随时间延长，各组BBB评分存在不同程度的回升(与同组前一时间点比较，P＜0.01);D组BBB评分于术后3个时间点均低于B组和C组(P ＜0.01)，而明显高于 E、F、G 组评分(P ＜0.01);B组与C组比较，BBB评分差异无统计学意义(Ρ＞0.05);E组术后3个时间点BBB评分均显著高于F组和G组(P＜0.01)，G组评分于术后12h、24h与 F组比较无差异(Ρ ＞0.05)，于术后48h低于F组(P＜0.01)(见表2)。

2.3 病理学观察及神经元计数 A组脊髓灰质内可见大量大小不一的NeuN免疫阳性细胞分布，前角Ⅷ、Ⅸ板层神经元胞体体积明显大于周围的细胞，细胞呈多角形，胞体呈特征性的突起结构，细胞核深染，体积大而圆，核仁明显，而胞浆和突起染色较浅。F、G组大量神经元出现胞体萎缩、空泡样变，胞浆中尼氏体消失，细胞核破裂，染色质溶解、边聚，Ⅷ、Ⅸ板层内正常神经元数明显低于其它各组(Ρ＜0.01)。E组仅部分神经元出现胞核溶解、破裂，Ⅷ、Ⅸ板层内正常神经元数低于 A组(P＜0.01)。B、C、D 组灰质内细胞形态及Ⅷ、Ⅸ板层内神经元数量与A组相比无差异(P＞0.05)。

表1 7组大鼠不同时刻MAP、PR、Tr的比较(χ ± s，n=8)

表2 7组大鼠术后不同时刻BBB评分比较(χ ± s，n=8)

3 讨论

本实验通过电凝肾上腹主动脉发出的椎动脉和结扎肾下腹主动脉阻断腰段脊髓血液供应的方法，有效降低阻断后股动脉压力，并于开放腹主动脉后实现脊髓再灌注。改良脊髓缺血再灌注损伤模型可以明显降低大鼠术后12h、24h、48h BBB评分，且缺血90min、120min再灌注可导致大鼠BBB评分降低更为明显，脊髓前角运动神经元大量死亡，说明改良的脊髓缺血再灌注损伤模型是一种科学可靠的动物试验模型。

尽管改进外科手术技术和应用多种脊髓保护措施，SCII发生率近年来呈上升趋势，且治疗棘手。脊髓损伤程度与缺血时间密切相关，缺血时间越长，损伤程度越重，甚至进入不可逆损伤期。因此，研究脊髓缺血损伤的防治前提是根据具体研究目的做出科学合理的实验动物模型，阐明其病理机制并寻找合理的治疗途径。目前局灶性脊髓缺血模型制作的主要方法为:夹闭法、体外松解法、气囊栓塞法和脂肪栓塞法［4］。

大量研究证实对主动脉结扎能够有效地模拟临床常见的由于动脉供血不足或障碍所造成的SCII。姚俊岩［5］等对新西兰大白兔肾下腹主动脉分别结扎20min、25min、30min、40min 和 60min，再灌注 48h 后出现截瘫的发生率分别为0%、30%、80%、90%及100%，脊髓组织出现神经细胞肿胀、坏死等改变，且损伤程度随阻断时间的延长而逐渐加重。管玉龙［6］等钳夹降主动脉30min后再灌注，术后3h～7d 83.3%小型猪后肢肌力下降为0～Ⅰ级，电镜观察到髓鞘板层结构松解、轴索收缩。肖红［7］等对家犬肾前及肾后腹主动脉分别钳夹30min、60min、90min及120min后开放腹主动脉再灌注，结果肾前型阻断动物全部死亡，而肾后型阻断动物均存活，但无一只动物出现脊髓神经功能损伤特征性表现。主动脉阻断法是指在主动脉水平阻断血流以减少脊髓血供，该方法较为简单，应用广泛。由于胸主动脉阻断在致脊髓损伤的同时也可导致肝、肾等重要脏器的损伤，降低动物存活率。为了避免或减轻重要脏器的损伤，提高动物存活率，本实验采用肾下腹主动脉结扎术阻断腰段脊髓血液供应，建立脊髓缺血再灌注损伤模型。单纯阻断肾下腹主动脉 60min、90min、120min再灌注48h，所有大鼠均存活，后肢活动障碍不明显，BBB评分于术后12h低于假手术组，随后逐渐回升，并于48h恢复到18分以上，且脊髓灰质神经元未见明显坏死，前角正常运动神经元数量无减少。可见，单纯阻断大鼠肾下腹主动脉不能完全造成腰段脊髓缺血，需要继续改善该动物模型。

大鼠以其繁殖力强、易于饲养、价格便宜等特点成为各类研究最常应用的实验动物之一，对大鼠建立脊髓缺血再灌注损伤模型具有良好的实用价值和推广前景。然而大鼠的解剖结构和生理特性与其它实验动物存在一定的差异。对大鼠解剖发现其胸腰段脊髓的血供相当丰富，几乎每组神经根或每隔一组神经根就伴有根动脉通向脊髓前后方，阻断肾下腹主动脉后用亚甲蓝灌注发现腰段脊髓被染成蓝色，可见肾上腹主动脉发出的椎动脉可能向尾端发出侧枝营养腰段脊髓。基于此，本实验采用双极电凝切断肾上腹主动脉发出的椎动脉，在最大限度地减少腰段脊髓血液代偿供应的同时不影响肝、肾等重要腹腔脏器的血液供应，再联合肾下腹主动脉结扎术即可实现对腰段脊髓血供的有效阻断。

本研究中，改良(E、F、G)组术后3个时间点BBB评分均显著低于对照(B、C、D)组和假手术组，以F、G组降低最为明显，且该两组动物出现排便障碍，脊髓灰质神经元大量坏死，前角正常运动神经元数量明显低于其它各组。可见，改良的脊髓缺血再灌注损伤模型阻断90min以上能够有效阻断大鼠脊髓腰段血液供应，导致大鼠神经行为学障碍及脊髓病理组织结构改变，是研究脊髓缺血损伤和再生修复机制的理想模型。

因此，电凝肾上腹主动脉发出椎动脉联合结扎肾下腹主动脉可有效阻断腰段脊髓血液供应，且脊髓常温下耐受缺血时限为90min。改良模型是一种科学可靠的脊髓缺血再灌注损伤动物模型，可以在脊髓损伤保护研究中推广应用。

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［4］张静萍，高旭光.局灶性脊髓缺血模型研究现状［J］.中国脊柱脊髓杂志，1997，7(3):134-135.

［5］姚俊岩，翁 浩，张 兰，等.脊髓缺血再灌注损伤模型的改进及脊髓耐受缺血时限的研究［J］.四川大学学报(医学版)，2007，38(3):497-500.

［6］管玉龙，刘 锋，董培青，等.脊髓缺血损伤动物模型的建立［J］.中国体外循环杂志，2006，4(1):46-48.

［7］肖 红，张 兰，王泉云，等.经腹主动脉阻断致犬脊髓缺血再灌注损伤实验模型的探讨［J］.四川医学，2007，28(12):1309-1311.