RP-HPLC法测定桑姜感冒胶囊中绿原酸的含量

李胜囡，韩本序，刘圣旭，肖培云

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

桑姜感冒胶囊是常用的中成药制剂，由桑叶、菊花、紫苏、连翘、苦杏仁、干姜等中药提取加工制成，具有散风清热，祛寒止咳等功效，用于感冒、咳嗽、头痛、咽喉肿痛〔1〕。绿原酸为桑姜感冒胶囊配方中的桑叶、菊花、连翘三味药材的主要活性成分之一〔2〕，但现行质量标准中并未对其含量进行控制，本文建立了反相高效液相色谱法测定绿原酸的含量，能有效控制该药品的质量。所建立的方法操作简便、结果准确、重复性好，适用于桑姜感冒胶囊中绿原酸的含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Agilent 1200高效液相色谱仪；SK3200LH超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AL204-IC电子分析天平（ Mettler Toledo）。

1.2 试药 绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413），桑姜感冒胶囊（ 四川好医生药业集团有限公司，批号110148、110127、110116）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agela XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（ 9∶91）〔3-4〕；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：327 nm〔5-8〕；进样量：10 μL，绿原酸与相邻峰达到基线分离，理论板数按绿原酸峰计不低于5000。HPLC色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品10 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇适量，溶解，定容，摇匀，即得浓度为1.0 mg/mL的对照品储备液。精密移取对照品储备液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。

图1 桑姜感冒胶囊HPLC色谱图

2.3 供试品溶液的制备 取胶囊10粒，取出内容物，称重，计算平均粒重。精密称取供试品内容物约1.0 g，置100 mL圆底烧瓶中，加60%甲醇25 mL，称重，超声处理（ 功率：500 W，频率：40 kHz）40 min，补重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 阴性对照液的制备 按处方比例，制备除桑叶、菊花、连翘外的阴性样品〔9-10〕，按“ 2.3”项下方法制备阴性对照溶液，依法测定，结果表明阴性对照液无干扰，见图1。

2.5 提取溶剂浓度的考察 精密称取样品7份，每份约1.0 g，分别加40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇25 mL，超声提取40 min，补重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液进样10 μL，测定绿原酸的峰面积，并计算绿原酸的平均含量。得提取溶剂浓度与峰面积的关系如图2，故选择60%的甲醇作为提取溶剂。

图2 提取溶剂浓度与峰面积的关系

2.6 提取时间考察 精密称取样品6份，每份约1.0 g，加60%的甲醇25 mL，分别超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）10、20、30、40、50、60 min，按“ 2.1”项色谱条件进行测定，测定绿原酸的峰面积，并计算绿原酸的平均含量，结果表明超声40 min即可将样品中的绿原酸提取完全。因此，选择提取时间为40 min。 见图3。

图3 提取时间与峰面积的关系

2.7 线性关系的考察 精密吸取0.1 mg/mL对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，依次进样，以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=9.0×10-4C-0.2095，r=0.9998， 结果表明绿原酸进样量在0.02～0.25 μg范围内呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验 取对照品溶液按“2.1”项色谱条件，每次进样10 μL，重复进样6次，测定峰面积，结果峰面积平均值为2349.55，RSD为0.70%（ n=6），表明进样精密度良好。

2.9 重复性试验 精密称取同一批号（110148）样品5份，按“ 2.3”项处理，按照“ 2.1”项色谱条件测定峰面积，结果供试品中绿原酸的平均含量为1.62 mg/g，RSD为1.60%，结果表明本实验重复性良好。

2.10 稳定性试验 按“2.3”项制备供试品溶液，分别在2、4、8、12、24 h进样10 μL， 测得绿原酸的RSD为1.30%（n=5），表明样品溶液在24 h内稳定性好。

2.11 加样回收率试验 取本品（批号110148，含量1.62 mg/g）10粒的内容物，混匀，精密称取约0.5 g，共6份，按表1精密加入绿原酸对照品溶液，按“2.3”项步骤操作，按照“2.1”项色谱条件测定峰面积，计算回收率，见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.12 样品的测定 取3个不同批号的供试品，按“2.3”项步骤操作，并按“2.1”项色谱条件测定，进样10 μL，测定峰面积，按外标法计算绿原酸的含量，结果3批样品中绿原酸的含量分别为1.57、1.57、1.39 mg/g。

3 讨论

在流动相的选择过程中，试验比较了乙腈与水、乙腈与0.2%磷酸、乙腈与0.4%磷酸的多种不同配比，结果流动相为乙腈：0.4%磷酸（9∶91）出峰时间适当，绿原酸与邻峰能达到较好的线分离，峰的对称性好，故选择乙腈0.4%磷酸（9∶91）为该试验的流动相。

文献报道，绿原酸对热不稳定，温度太高绿原酸发生离解，温度太低不利于绿原酸的溶出，故选择50℃作为提取温度。

曾考察分别用甲醇和乙醇作为提取溶剂，但结果表明在相同提取时间内甲醇的提取效率更高，这可能与甲醇的分子小，对植物细胞的穿透作用强，活性成分的溶出率高有关，故本试验采用甲醇作为提取溶剂。

采用RP-HPLC法测定桑姜感冒胶囊中绿原酸的含量，操作简便、方法可靠、结果准确、灵敏度高、重复性好，进一步提高、完善了原质量标准。

〔1〕中华人民共和国药典编委会.中华人民共和国药典：一部〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2010：405-406.

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