妥布霉素生物合成中磷酸盐的调节研究

刘 平

（丹东市食品药品检验所，辽宁 丹东 118002）

在庆大霉素生物合成过程中，高浓度磷酸盐阻遏从葡萄糖至2-DOS（2-脱氧链霉胺）之间的转氨酶，从而影响产抗单位[1]。

妥布霉素（Tobramycin）属第二代氨基糖苷类抗生素，作用于细菌30S核糖体亚基，抑制菌体蛋白质的合成，是广谱高效力抗生素，在体外对多种细菌具有抗菌的活性，特别是对某些庆大霉素耐药的绿脓杆菌活性更为显着[2]。妥布霉素是黑暗链霉菌（S.tenebrariuys）发酵液中分离到的尼拉霉素（Nebramycin）复合物中的一个组分。尼拉霉素复合物其中主要组分为2、4、5′三个组分。组分5′为6”-O-氨甲酰妥布霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）。组分6（妥布霉素）可分别由组分4和组分5′经水解制得[3]。目前，国内妥布霉素产生菌主要产生组分2和组分5′两个组分，由于提取、精制的步骤复杂，成本较高。为了提高菌株生产能力，降低妥布霉素生产成本，很多人已经在菌种选育方面作了大量工作，但是对于CTB生物合成的调节机制研究很少，本文初步探讨了磷酸盐调节CTB生物合成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑暗链霉菌201-420（S.tenebrariuys201-420），总效价1143U/mL，CTB百分含量88.5%；检定菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 63501）。

1.2 培养基（%）

1.2.1 斜面培养基

高氏一号种子培养基：葡萄糖1.0，黄豆粉1.0，蛋白胨0.3，玉米粉0.5，酵母粉0.1，CaCO30.1。

1.2.2 发酵培养基

黄豆粉4.0，葡萄糖4.0，蛋白胨1.0，CaCO30.5，MgSO4•7H2O 0.4，MnCl20.03，FeSO40.005，ZnSO40.003，NH4Cl 0.1%，豆油1.0。

1.2.3 鉴定培养基

蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，K2HPO4 0.3，琼脂2.2，pH 7.8～8.0。

1.3 效价测定方法

二剂量法（中国药典2005年版）

1.4 细胞破碎方法

将发酵液离心收集菌体，洗涤，置-70°C冰箱反复冻融3次，用超声波破碎仪破碎菌体。

2 实验结果与讨论

2.1 37h补加磷酸盐对发酵效价的影响

见图1。由图1可以看出，37h补加低浓度磷酸盐时，有促进产生抗生素的作用，而当最终的作用浓度达到0.1%以上的时侯，效价就会显著下降。磷酸盐对各种抗生素合成的调节有不同的机制。所以，在下面的实验中，作者考察了磷酸盐调节CTB生物合成一种可能的机制。

2.2 高浓度磷酸盐阻遏从2-脱氧肌醇到2-DOS之间的转氨酶2-DOS是氨糖类抗生素重要的生物合成中间体，从葡萄糖至2-DOS的生物合成途径中，如图2，葡萄糖首先转变成为2-脱氧肌醇，然后再经过两次氧化、氨基化作用，转变成为2-DOS[4]。根据报道，在庆大霉素生物合成的过程中，高浓度的磷酸盐阻遏了从葡萄糖到2-DOS之间的L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇单酮转氨酶。因而影响氨基化作用，进而影响产生抗生素[3]。在以下的实验中，我考察了在CTB的生物合成过程中是否也存在相同的作用机制。

图1 37h补加磷酸盐对发酵效价的影响

2.3 高浓度磷酸盐与氯霉素作用效果比较为了考察高浓度磷酸盐的负调控作用是通过阻遏某种酶的合成还是抑制某种酶的活性，我比较了高浓度的磷酸盐与氯霉素的作用效果，因为氯霉素是蛋白质合成抑制剂，发酵37h，同时向发酵液中添加一定浓度的氯霉素和高浓度的磷酸盐，若两者对CTB生物合成的作用效果一致，则表明磷酸盐是通过阻遏某种酶的合成而影响抗生素的合成。结果如图2所示。由图2中可以看出，氯霉素对菌体的生长没有影响。可氯霉素和高浓度磷酸盐对CTB生物合成的作用效果基本一致，这表明磷酸盐是通过阻遏CTB生物合成过程中的某个酶的合成而起作用的。

图2 高浓度磷酸盐与氯霉素作用效果比较

2.4 高浓度磷酸盐阻遏从2-脱氧肌醇到2-DOS之间的转氨酶 为了考察磷酸盐具体阻遏了CTB生物合成过程中哪一个步骤，我在发酵37hr，向发酵液中添加11.6 mmol/L的磷酸盐，使抗生素的合成被抑制，并且在发酵73h，加入不同浓度由葡萄糖到2-DOS之间几种可能的前体物质或中间体。由表1看出：只有73h，加入30mmol/L以上的氨基葡萄糖。由此，可以推测同庆大霉素一样磷酸盐阻遏了。

表1 Specific antibiotic produced by phosphate repress cultures supplementedwith precursors and intermediates of the CTB biosynthetic pathway

3 结 论

通过上面的实验，我们可以得出下面的结论：在发酵过程中加入5.75mmol/L以上磷酸盐，对CTB的生物合成发生明显的负调控作用。其原因可能是：磷酸盐本身阻遏L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇单酮转氨酶的合成。从而影响了从葡萄糖合成2-DOS的氨基化作用。

[1] Obregon AM.Physioloical studies on getamicin：Phosphate repression of antibiotic formation[J].J Antibiotics,1994,47(12)：1442-1446.

[2] 张淑华,李蓉以,廖勇.国产妥布拉霉素和阿普拉霉素对绿脓杆菌体外抗菌活力的研究[J].抗生素,1986,11(3)：239.

[3] Koch,K.Nebramycin：seperation of the complex and identification of factor 4,5and 5’,J[J].Antibiotics,1973,26(12)：745-751.

[4] Rinehart KL Jr,Malik JM,Nystrom RF,et al.Biosynthetic incorporation of [1-13C] glucosamine(*)and [6-13C] glucose into neomycin,J[J].Am Chem.Soc,1974,96(5495)：2263-2265.