滋肾降糖丸对高脂小鼠模型胰岛素敏感性的影响及其机制

肖永平 郭 彬 凌英蓉

（广东省深圳市中医院药剂科，广东 深圳 518033）

2型糖尿病占糖尿病绝大多数，主要表现为胰岛素抵抗。改善胰岛素敏感性已成为2型糖尿病治疗的关键[1]。目前提高胰岛素敏感性的药物主要为噻唑烷二酮类，但其副作用较大[2]。第一代噻唑烷二酮类如曲格列酮因肝脏毒性而退市，2010年10月，欧洲市场因罗格列酮的心脏毒性而宣布退市。中药尽管直接降糖作用微弱，但副作用较小，在防治并发症及改善胰岛素敏感性方面可能具有一定的优势[3]。滋肾降糖丸为临床作用应用多年的经典中药复方，主要成分由黄芪、党参、龟甲、三七、地黄、熟地、五味子、黄精、牛膝、牡蛎、骨碎粉等组成，主要功效为益气养阴、调节血糖，滋肾壮骨[4,5]。前期临床研究发现该方可调节血糖，但具体机制不是很清楚。本研究主要通过高脂饲喂的小鼠模型制作胰岛素抵抗的模型，探讨了滋肾降糖丸对胰岛素敏感性的影响及其相关机制，从而为临床相关用药奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 食物和动物

3周龄的C57BL/6J小鼠[SPF级, 合格证号SCXK（沪） 2007-0005]购自上海史莱克实验动物有限公司。动物饲养在清洁级动物房（温度：（20±2）℃，湿度：（60±5）%，12h/12h昼夜交替光照）。动物自由摄食。普通和高脂食物购自上海史莱克实验动物有限公司。普通食物含20.5%粗蛋白，4.62%粗脂肪，52.5%无氮提取物，4.35%粗纤维（总卡路里3.45 Kcal/g，12%卡路里为脂肪）。高脂食物含有18.8 %粗蛋白，16.2%粗脂肪，45.2%无氮提取物，3.98% 粗纤维（总卡路里3.79 Kcal/g，38%的卡路里为脂肪）。

表1 葡萄糖转运体4( Glut4)和GAPDH引物设计

表2 Changes of blood glucose,triglycerides,total cholesterol,insulin levels,and insulin index in high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT.

1.2 实验设计

选取刚断乳的C57BL/6J雄性小鼠（12g左右）。实验分为5组：正常饲料组，高脂模型组，高脂模型加滋肾降糖丸（深圳中医院药剂科制备）大（400mg/kg/d）、小剂量组（200 mg/kg/d），高脂模型加非诺贝特组（200 mg/kg/d）。每组10只C57BL/6小鼠。测试药用双蒸水溶解，均按0.2ml/10g灌胃给药，连续给药4组，对照组服用相应体积的双蒸水。实验期间每周定期监测体重，食物摄取量。实验后取血检测血糖，血脂和胰岛素水平，实验前禁食6h。实验结束后剥离小鼠后肢肌肉组织，液氮瞬时冷冻后，储存于－80℃冰箱备用。血糖、总胆固醇、甘油三酯用商业试剂盒进行检测 （北京中生北控股份有限公司）。血胰岛素用ABC-ELISA试剂盒 （上海西唐生物科技有限公司）。胰岛素敏感性指数计算为1/（空腹血糖×血胰岛素），其值越大，敏感性越高。

1.3 实时荧光定量PCR

随机取新鲜准备的肌肉组织（n=6），总RNA用Trizol试剂提取。用大连宝生物工程有限公司TaKaRa的SYBR® Premix Ex Taq™ II（TaKaRa Code：DRR081）试剂进行实时荧光定量PCR（q-PCR）。检测在7500 Real Time PCR 系统 （Applied Biosystems，美国）。程序设置为95℃×30sec，接着95℃×5 sec，60℃×34sec进行40个循环，GAPDH作为内标。所有的样品测试三次。 葡萄糖转运体4（Glut4）和GAPDH引物设计如下为（表1）。

1.4 统计分析

数据表示为均数±标准差，组间采用单因素方差分析（ANOVA），之后用Newman–Keuls比较检测其显著性，P＜0.05视为具有显著性差别。

2 实验结果

2.1 滋肾降糖丸对血糖、血脂、胰岛素、胰岛素敏感指数的影响高脂小鼠血糖、血胆固醇、血胰岛素水平出现显著升高，而胰岛素敏感指数显著降低（表2）。滋肾降糖丸大剂量显著抑制血糖、血胆固醇和胰岛素水平的增加，同时显著增加胰岛素敏感性指数。滋肾降糖丸小剂量组作用较弱。阳性药物非诺贝特作用较强，显著抑制血糖、血胆固醇和胰岛素水平的增加，同时显著增加胰岛素敏感性指数。

2.2 滋肾降糖丸对肌肉Glut4基因表达的影响

和正常小鼠比较，高脂小鼠肌肉Glut4 mRNA的表达显著降低，但滋肾降糖丸大、小剂量均显著增加Glut4 mRNA的表达，且有一定剂量依赖关系。非诺贝特作用更强。见图1。

3 讨 论

图1 Expression of Glut4 mRNA in muscles of high-fat fed mice after 4 weeks of treatment of ZSJT. aaP＜0.01 vs Normal; bbP＜0.01 ZSJT vs HFD; ccP＜0.01 Fenofibrate vs Normal. Normal，normal control mice; HFD，high-fat diet-fed control mice; ZSJT-400，Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(400mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice; ZSJT-200，Zhi-Shen-Jiang-Tang Pill(200mg/kg)-treated high-fat diet-fed mice.

高脂小鼠通过一定时间饲喂后，将表现出胰岛素抵抗的现象，是糖脂代谢紊乱的关键。改善胰岛素敏感性是该疾病治疗的关键。滋肾降糖丸为深圳市中医院临床应用多年的中药复方制剂，临床研究发现，该药具有调节血糖的作用，然而具体的机制不是很清楚。本研究中我们发现滋肾降糖丸适度控制血糖水平，尽管作用较弱，但显著改善胰岛素敏感性指数，降低体内胰岛素水平。Glut4是转运葡萄糖进入细胞内的关键因子，其表达增加将有可能增加葡萄糖的摄取，改善胰岛素敏感性[6]。该研究表明滋肾降糖丸显著增加Glut4的基因表达的作用，因而我们推测滋肾降糖丸改善胰岛素敏感性的作用可能与此有关。尽管滋肾降糖丸作用较阳性药物为弱，但副作用较小，因此在辅助治疗方面仍将具有一定的应用前景。特别指出2型糖尿病、肥胖和代谢综合征都有胰岛素抵抗的特征，因此滋肾降糖丸在这一类疾病中可能具有广泛的用途。

滋肾降糖丸具有改善胰岛素敏感性的作用，其机制可能与上调肌肉组织中Glut4的表达有关。

[1] Frøsig C,Richter EA.Obesity (Silver Spring).Improved insulin sensitivity after exercise： focus on insulin signaling[J].Obesity(Silver Spring).2009,17(3)：15-20.

[2] Liao X,Wang Y,Wong CW.Troglitazone induces cytotoxicity in part by promoting the degradation of peroxisome proliferatoractivated receptor γ co-activator-1α protein[J].Br J Pharmacol.2010,161(4)：771-781.

[3] Chao M,Zou D,Zhang Y,et al.Improving insulin resistance with traditional Chinese medicine in type 2 diabetic patients[J].Endocrine,2009,36(2)：268-274.

[4] 李惠林,黄皓月,张志玲,等.滋肾降糖丸治疗肾虚型2型糖尿病30例疗效观察[J].新中医,2006,38(2)：50-51.

[5] 吕萍,龙新生,王菊萍,等.滋肾降糖丸质量标准的研究[J].中国中医药科技,2004,11(6)：362-363.

[6] Van Proeyen K,Szlufcik K,Nielens H,et al.Training in the fasted state improves glucose tolerance during fat-rich diet[J].J Physiol,2010,588(21)：4289-4302.