高糖环境下exendin－4对人肾小管上皮细胞CTGF、BMP－7表达的影响

张继敏 兰丽 珍孔瑜

高糖环境下exendin－4对人肾小管上皮细胞CTGF、BMP－7表达的影响

张继敏 兰丽 珍孔瑜

目的探讨exendin－4对高糖环境下人肾小管上皮细胞(HK－2)结缔组织生长因子(CTGF)、骨形态发生蛋白－7 (BMP－7)蛋白和mRNA表达的影响。方法将体外培养的HK－2细胞分为正常糖对照组(NG)、高糖组(HG)、甘露醇组(MG)、高糖+不同浓度的exendin－4组(分别exendin－4 10、20、40pmol/L)，于培养48h后，采用免疫细胞化学、RT－PCR方法检测HK－2细胞CTGF、BMP－7蛋白和mRNA表达量。结果与NG相比，HG组HK－2细胞CTGFmRNA和蛋白表达明显升高(P＜0．05)，BMP－7 mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0．05)，加入exendin－4的各组HK－2细胞CTGF表达较HG组均明显降低(P＜0．05)，BMP－7的表达较HG组均明显升高(P＜0．05)。结论exendin－4可能会通过抑制高糖环境下HK－2细胞CTGF高表达，提高BMP－7的表达，改善糖尿病肾病。

胰高血糖素样肽－1exendin－4人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子骨形态发生蛋白－7

材料与方法

1．材料:(1)细胞株:人肾脏近端小管上皮细胞株(HK－ 2)购自中国协和医科大学细胞中心。(2)实验药物与主要试剂:exendin－4(东莞宝丽健生物工程研究开发有限公司);胎牛血清、DMEM低糖和高糖培养基(HyClone公司);二甲基亚砜(美国Sigma公司);胰蛋白酶－EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司)。兔抗BMP－7多克隆抗体、兔抗CTGF多克隆抗体、DAB显色剂(武汉博士德公司)，TRIzolRNA提取试剂盒(Invitrogen公司)、PCR引物(上海生物工程有限公司);反转录(RT)试剂盒(Fermentas公司)，荧光定量PCR试剂(Roche公司)。(3)实验主要仪器:CO2恒温培养箱(日本SANYO公司);生物净化工作台(苏州净化设备有限公司);倒置显微镜(重庆光电仪器总公司);BI－2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司);荧光定量PCR仪TL988(西安天隆科技有限公司)。

2．方法:(1)细胞培养及分组:HK－2细胞系用含10%灭活胎牛血清的低糖DMEM培养液(D－葡萄糖浓度5.5mmol/L)于37℃、5%CO2培养箱中传代培养，每2～3天更换1次培养液，待细胞生长至70%～80%时更换为无血清DMEM培养液，使细胞生长同步化24h。将细胞分为以下各组:①正常糖对照组(NG组含5．5mmol/L D－葡萄糖);②高糖组(HG组含30mmol/L D－葡萄糖);③甘露醇组(MG组含24．5mmol/L甘露醇和5．5mmol/L D－葡萄糖，终浓度为30mmol/L);④HG+不同浓度exendin－4干预组(HG+exendin－4组)，exendin－4终浓度分别为10、20、40pmol/L。48h后取样观察，每组均含3瓶细胞(n=3)。(2)免疫细胞化学染色:按实验分组条件于6孔板中培养细胞，细胞爬片经PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定，0．1%TritonX－100打孔，5%BSA封闭，然后用一抗为兔抗BMP－7多克隆抗体(1∶50，武汉博士德公司)，兔抗CTGF多克隆抗体(1∶100，武汉博士德公司)，4℃孵育过夜，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。第2天滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min，DAB显色。苏木精复染细胞核，中性树胶封片，拍照。图像用BI－2000医学图像分析系统进行分析，随机不重复选取10个高倍视野，测阳性细胞的平均光密度值。(3)RT－PCR法检测各组HK－2细胞中BMP－7、CTGFmRNA表达:收集细胞，加入1mlTrizol提取总RNA，反转录成cDNA进行PCR反应，按反转录试剂盒说明操作，内参为人的β－actin。PCR引物序列:β－actin扩增片段为184bp，上下游引物分别为5'－AGAGCTACGAGCTGCCTGAC－3'和5'－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3';CTGF扩增片段为153bp，上下游引物分别为5'－GGAAAAGATTCCCACCCAAT－3'和5'－TGCTCCTAAAGCCACACCTT－3';BMP－7扩增片段为133bp，上下游引物分别为5－TTTTCTGGATCCTCCATTGC－3'和5'－CAAAAGCCATATGCTGCTCA－3'。反应条件为:94℃预变性10min;94℃变性15s，58℃退火60s，45个循环结束。重复3次独立的RTPCR全过程。荧光定量TL988PCR仪进行定量分析，目的基因扩增用CT值，首先计算各样本测定基因X:CT与内对照基因β－actin CT的差值，即ΔCT=CT(X)－CT(β－actin)，再用各实验组样本的ΔCT减去正常对照组样本的ΔCT，得到ΔΔCT，利用2－ΔΔCT计算基因表达情况。

3．统计学方法:全部数据经SPSS 17．0软件包进行统计，以均数±标准差±s)表示，用单因素方差分析进行分析，两两比较用LSD－t多重比较，P＜0．05为差异有统计学意义。如果资料不符合正态分布，则采用非参数检验。

结果

1．各组细胞CTGF、BMP－7蛋白表达水平:HK－2细胞阳性染色为胞质呈黄色至棕黄色颗粒状，阴性胞质为淡紫蓝色，胞核为蓝色。结果显示:NG组和MG组，CTGF有弱阳性信号表达，BMP－7有阳性信号表达;HG组，CTGF阳性表达较NG组和MG组显著增加(P＜0．05)，BMP－7阳性表达显著降低(P＜0．05);与HG组相比，HG+不同浓度exendin－4组CTGF阳性表达均明显降低(P＜0．05)，BMP－7阳性表达均明显升高(P＜0．05)，且都呈浓度依赖性，但HG+不同浓度exendin－4组的CTGF、BMP－7阳性表达水平均未恢复到NG组水平(P＜0．05，表1及图1、图2)。

表1 各组肾小管上皮细胞CTGF、BMP－7的平均光密度±s)

表1 各组肾小管上皮细胞CTGF、BMP－7的平均光密度±s)

与NG组相比较，*P＜0．05;与HG组相比较，#P＜0．05;多重比较，ΔP＜0．05

组别CTGFBMP－7 NG0．191±0．0180．321±0．009 MG0．187±0．0160．320±0．017 HG0．378±0．018*0．213±0．021* HG+exendin－4 10pmol/L0．332±0．017*#Δ0．237±0．017*#Δ 20pmol/L0．289±0．010*#Δ0．269±0．015*#Δ 40pmol/L0．234±0．020*#Δ0．304±0．015*#Δ

2．各组细胞CTGF及BMP－7mRNA表达水平: NG组和MG组，CTGFmRNA有微量水平的表达，BMP－7mRNA高表达;HG组CTGFmRNA表达较NG组明显升高(P＜0．05)，BMP－7mRNA表达较NG组明显下降(P＜0．05)，与HG组相比，HG+exendin－4(10pmol/L)组、HG+exendin－4(20pmol/L)组、HG +exendin－4(40pmol/L)组HK－2细胞CTGFmRNA表达均下调(P＜0．05)，BMP－7mRNA表达均上调(P＜0．05)，且均呈浓度依赖性，但都没有恢复到NG组水平(表2)。

表2 各组肾小管上皮细胞CTGF及BMP－7mRNA的2﹣ΔΔCT(n=3±s)

表2 各组肾小管上皮细胞CTGF及BMP－7mRNA的2﹣ΔΔCT(n=3±s)

与NG组比较，*P＜0．05;与HG组比较，#P＜0．05;多重比较，ΔP＜0．05

组别CTGFBMP－7 NG11 MG0．972±0．2290．955±0．182 HG6．163±0．161*0．183±0．040* HG+exendin－4 10pmol/L4．486±0．285*#Δ0．286±0．048*#Δ 20pmol/L3．181±0．244*#Δ0．415±0．036*#Δ 40pmol/L2．001±0．378*#Δ0．602±0．117*#Δ

讨论

肾间质纤维化是多种原因引起的慢性肾脏疾病进展为肾衰竭的共同通路，肾小管上皮损伤后的病理改变是肾间质纤维化的始动因素［3］。在糖尿病持续高血糖状态下，尿糖的产生及肾小管间质组织和周围血管中葡萄糖浓度的升高，诱导肾小管细胞凋亡，促使小管萎缩，进而发展为肾小管纤维化。它的形成是一个多因素、多细胞参与的复杂过程，尤其是促纤维化因子和抗纤维化因子的失衡。

CTGF是一种新发现的具有多种功能的细胞因子，多种肾组织细胞均可分泌，近年，随着对CTGF结构和生物学功能的深入研究，CTGF在DN肾间质纤维化的作用越来越重要。CTGF是转化生子因子－β (transforming growth factor－β，TGF－β)发挥其致纤维化效应的下游因子，它不仅引起肾小球硬化，还可促进肾小管间质纤维化［4］。研究发现链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织中CTGF蛋白和mRNA表达水平均明显升高［5］。Umezono等［6］利用原位杂交方法观察DN患者肾活检标本，发现在肾间质小管萎缩和间质纤维化区域CTGFmRNA表达较高，且与纤维化程度有关。这些均提示CTGF在糖尿病肾病肾小管间质纤维化发展过程中是一个关键性致病因子。本研究表明在高糖刺激下，HK－2细胞CTGF蛋白及mRNA表达明显增加。甘露醇组与低糖组相比，CTGF表达无明显变化，说明该作用与高糖所导致的高渗透压无关。exendin－4干预组CTGF的表达均较高糖组明显减少。有研究表明，exendin－4可通过作用于肾脏的GLP－1受体抑制TGF－β的表达，改善糖尿病肾病［7］。由此可推测，exendin－4可能通过抑制TGF－β，进而阻止其发挥生物学效应的下游因子CTGF的表达，改善高糖所致肾间质纤维化。

BMP－7是新发现的肾脏内分泌激素，属于TGF－β细胞因子超家族，在抗肾间质纤维化中扮演着重要的角色，是一种有效的肾脏保护因子。BMP－7主要表达于肾脏远端小管和集合管，在近段小管有少量表达。肾脏疾病时，BMP－7可通过抑制上皮细胞的凋亡、促进肾间质细胞外基质的降解、减少促炎症因子释放、对抗TGF－β1的致肾纤维化作用来保护肾脏。同时，BMP－7还可通过促进E－钙黏蛋白的重新表达，促使间质细胞向正常上皮细胞转分化，恢复肾脏正常结构和功能［8］。本研究结果表明在低糖组HK－2细胞中BMP－7mRNA和蛋白有少量表达［9，10］。与正常糖组相比，高糖作用下的肾小管上皮细胞BMP－7蛋白及mRNA表达明显降低。体外实验研究发现p38MAPK信号通路可能参与介导高糖刺激肾小管上皮细胞BMP－7表达的下调。在exendin－4组，肾小管上皮细胞BMP－7蛋白及mRNA表达较高糖组均明显上调［11］。至于exendin－4通过何种途径介导BMP－7表达增加有待进一步研究。其结果表明exendin－4可通过上调BMP－7的表达发挥对肾脏的保护作用，从而对DN肾小管间质纤维化的发生发展起到预防及逆转作用。

本研究结果提示，exendin－4可能会通过抑制肾组织CTGF的过度表达和升高肾组织BMP－7的表达，来延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的进展，为今后运用GLP－1治疗DN提供了实验依据。

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4Mason RM．Connective tissue g rowth factor(CCN2)，a pathogenic factor in diabetic nephropathy．What does it do?How does it do it［J］．J Cell Commun Signal，2009，3(2):95－104

5Lai PB，Zhang L，Yang LY．Quercetin ameliorates diabetic nephropathy by reducing the expressions of transforming growth factor－β1 and connective tissue growth factor in streptozotocin－induced diabetic rats［J］．Ren Fail，2012，34(1):83－87

6Umezono T，Toyoda M，Kato M，et al．Glomerular expression of CTGF，TGF－beta1 and type IV collagen in diabetic nephropathy［J］．J Nephrol，2006，19(6):751－757

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10Bramlage CP，Tampe B，Koziolek M，et al．Bone morphogenetic protein (BMP)－7 expression is decreased in human hypertensive nephrosclerosis［J］．BMC Nephrology，2010，11:31

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(收稿:2012－01－04)

(修回:2012－02－16)

Effect of Exendin－4 on the Expression of Connective Tissue Growth Factor(CTGF)and Bone Morphogenetic Protein－7(BMP－7)in Human Renal Tubular Epithelial Cell Cultured with High Concentration of D－glucose．

Zhang Jimin，Lan Lizhen，Kong Yu．Department of Endocrinology，The First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Shanxi 030001，China

ObjectiveTo investigate the effect of exendin－4 on the expression of connective tissue growth factor(CTGF)and bone morphogenetic protein－7(BMP－7)in human renal tubular epithelial cell cultured in high－glucose environment．MethodsHK－2 cells were subcultured under normal glucose(NG)，high glucose(HG)，mannitol glucose(MG)and high glucose with different concentrations of exendin－4 group(including exendin－4 10，20，40pmol/L)．The activity of CTGF and the expressions of BMP－7 protein and mRNA in cultured HK－2 cells were detected with immunocytochemistry and RT－PCR at 48h．ResultsCompared with the normal group，the expression of CTGF significantly increased in the high glucose group(P＜0．05)，the expression of BMP－7 significantly decreased in the high glucose group(P＜0．05)．Compared with the high glucose group，the expressions of CTGF was significantly lower in all the exendin－4 groups(P＜0．05)，the expressions of BMP－7 significantly increased in all the exendin－4 groups(P＜0．05)．ConclusionExendin－4 may modulate the process of diabetic nephropathy by inhibiting the expression of CTGF and increasing the expression of BMP－7 in high glucose－induced HK－2 cells．

Glucogon like peptide－1;Exendin－4;Human renal tubular epithelial cell;Connective tissue growth factor;Bone morphogenetic protein－7

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要微血管并发症之一，目前DN发病机制尚未完全清楚，以往对糖尿病肾病的研究多在肾小球方面，近年，肾小管上皮细胞在糖尿病肾病中的作用越来越引起人们的重视。就对肾功能的影响程度而言，肾小管病变较肾小球病变更为突出，且肾小管间质纤维化程度与肾功能衰竭的程度密切相关［1，2］。胰高血糖素样肽－1(glucogon like peptide－1，GLP－1)是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰岛素，GLP－1受体广泛分布于啮齿类动物和人体内。exendin－4是从生活在美国西南部的希拉毒蜥的唾液中分离出来的GLP－1类似物，在胰岛GLP－1受体介导下发挥调节血糖作用，属于GLP－1受体激动剂。近年来，人们对GLP－1的研究发现其对肾脏具有保护作用，但对于GLP－1的肾脏保护作用是否与调节CTGF、BMP－7的表达有关，目前国内外文献报道较少。本文旨在研究GLP－1类似物exendin－4对高糖条件下肾小管上皮细胞CTGF和BMP－7表达的影响，为糖尿病肾小管间质纤维化的防治提供一个新的途径。

030001太原，山西医科大学(张继敏、孔瑜);山西医科大学第一附属医院内分泌科(兰丽珍)

兰丽珍，电子信箱:lanlizhen@163．com