CTX-M-15基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌头孢他啶耐药株中的检测

李瑞华，聂大平，何丽敏

(1.大连医科大学附属第二医院检验科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学检验医学院，辽宁大连 116044)

CTX-M-15基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌头孢他啶耐药株中的检测

李瑞华1，聂大平1，何丽敏2

(1.大连医科大学附属第二医院检验科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学检验医学院，辽宁大连 116044)

［目的］了解CTX-M-15基因与大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢他啶耐药的关系。［方法］筛选ESBLs阳性且对头孢他啶耐药的菌株为实验组，对头孢他啶敏感而对头孢曲松耐药的菌株为对照组。多重PCR方法检测CTX-M-14，CTX-M-15基因。［结果］实验组CTX-M-15基因检出率高达75.9%，单纯CTX-M-15基因为40.6%，同时存在CTX-M15、CTX -M -14基因为35.2%。而对照组检出率分别为:17.7%、5.9%、11.8%。［结论］CTX-M-15基因是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢他啶耐药的主要机制，建议临床合理使用抗生素，避免引起流行。

CTX-M-15;头孢他啶耐药;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌

CTX-M型ESBLs在中国流行复杂，已成为最常见的基因型之一，主要以 CTX-M-14，CTXM -3为主，其次为 CTX -M -9 型等［1-4］。近年来，CTX-M-15型ESBLs在欧洲及澳洲一些国家流行［5-6］，此型酶表现出明显的水解头孢他啶的能力，国内CTX-M-15型酶也陆续被报道。本研究检测CTX-M-15、CTX-M-14基因，初步了解其在大连地区耐药菌中的比例及细菌耐药性。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

实验组:收集大连医科大学附属第二医院、部分大连医科大学附属第一医院及大连市中心医院2011年4月—2011年11月期间分离的产ESBLs肠杆菌科细菌且对头孢他啶耐药菌株共170株，其中大肠埃希菌94株，肺炎克雷伯菌76株;标本主要来源于尿液、痰液、血液、胆汁、分泌物等。对照组:同时期分离对头孢曲松耐药而对头孢他啶敏感的大肠埃希菌18株，肺炎克雷伯菌16株。标准质控菌株:阴沟肠杆菌ATCC700323;大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 主要仪器及试剂

细菌鉴定和药敏及ESBLs判定由VITEK2型全自动细菌鉴定药敏分析系统完成，药敏折点使用CLSI 2011年判定标准。引物由大连宝生物工程有限公司合成;PCR反应:由天根生化科技有限公司研制的一管便携式PCRMastermix完成。

1.3 DNA 的提取

煮沸法提取细菌DNA做为模板。

1.4 PCR 扩增

用多重PCR检测180株细菌中的ESBLs酶基因，所用引物见表1。(引物设计参见文献［3］)

表1 CTX-M-14和CTX-M-15基因的引物Tab 1 The primer of CTX-M-14 and CTX-M-15

PCR检测ESBLs基因反应体系:反应体系共25 μL。每条引物各1 μL，模板2 μL。用蒸馏水补足至25 μL。反应条件:预变性 94℃，5 min。循环:94℃，45 s;55℃，45 s;72℃，1 min;共30 个循环。最后延伸72℃，10 min。PCR产物经纯化、测序由大连宝生物工程有限公司完成，序列在GeneBank上检索比对，确认基因型。

PCR产物电泳:2%琼脂糖50 mL+1 μL溴化乙锭，100 V，稳压电泳20～30 min，最后在凝胶成像系统上拍照阅读结果。

1.5 统计学方法

应用SPSS11.0，两组率的比较使用采用 χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR产物电泳凝胶成像结果

临床株5在205 bp处出现条带，经测序证实为CTX-M-14;临床株6在415 bp处出现条带，经测序证实为CTX-M-15;其他临床株在205 bp、415 bp均有条带。见图1。

2.2 基因型检测结果

实验组具有水解头孢他啶活性的CTX-M型ESBLs主要以CTX-M-15为主，与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，对照组主要以CTXM-14为主。见表2。

2.3 产CTX-M型ESBLs对各类药物的耐药性

产CTX-M型ESBLs细菌对多种药物同时耐药，只有少数药物显示较好的活性。例如，头孢吡肟和氨曲南在实验组和对照组有较大差异。见表3。

图1 部分携带CTX-M-14与CTX-M-15型基因菌株PCR产物电泳结果Fig 1 Partial electrophoretic result of CTX-M-14 and CTXM-15

表2 CTX-M-15型、CTX-M-14型ESBLs的检出率Tab 2 The expression rate of CTX-M-14 and CTX-M-15 n(%)

表3 各类药物的耐药率比较Tab 3 Comparison of risistance rate (%)

3 讨 论

2009年，武学成等［1］报道深圳地区CTX-M型酶以CTX-M-14型为主，其次为CTX-M-15型;高伟等［2］报道安徽省产CTX-M型酶以CTXM-14型和CTX-M-3型为主，与此同时卓超等［3］对广州地区产CTX-M型超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究中发现CTXM-14和CTX-M-15为最主要的CTX-M型ESBLS的亚型。有学者对耐药机制研究发现CTXM-15、CTX -M -27、CTX -M -16型酶分别是由CTX-M-3、CTX-M-14和CTX-M-9型酶在240位天门冬氨酸→甘氨酸突变而来的［7］，说明突变使新型酶获得了水解头孢他啶的能力。甘氨酸由于缺乏相应的侧链，突变后降低了其对头孢他啶的空间阻碍，使酶的Km值降低，催化效能增加［8］，这使得CTX-M-15型酶水解头孢他啶的能力增加。另外，还有研究显示β3链和Ω环的控件状态及残基104ASN，237SER和276ARG等也被认为与对头孢噻肟水解特性有关［9］。如CTX-M型ESBLs氨基酸序列中第167位脯氨酸位于决定水解活性的Ω环，所以当该处氨基酸残基发生突变时，通常会导致其分子生物学特征改变，如脯氨酸突变为丝氨酸，分子间的作用力发生变化，分子构像发生改变，活性中心空间变大，才对头孢他啶的水解率大大增加。由于影响细菌对头孢他啶耐药因素很多，还需不断试验研究已获得更多信息来了解及控制细菌耐药。

本实验显示具有水解头孢他啶活性的CTX-M型ESBLs主要以CTX-M-15为主，检出率高达75.9%，单产CTX -M -15型酶为40.6%，同时产CTX-M -15、CTX-M -14为35.2%。这表明，CTX-M-15型ESBLs为目前大连地区肠杆菌科细菌对头孢他啶耐药的主要机制。本实验结果高于卓超等［3］对广州地区研究:CTX-M-15在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别为21.5%和26.1%，应该与实验分组有关。另外，本次研究中，检出4株菌存在CTX-M-15基因，但对头孢他啶敏感;而部分仅产CTX-M-14的菌株又表现出明显水解头孢他啶的能力，这些有待进一步研究。

鉴于CTX-M-15型ESBLs检出率较高，临床不宜单独使用头孢他啶治疗。从耐药结果(表3)可以看出产CTX-M-15型ESBLs较CTX-M-14型ESBLs的耐药性略高，尤其对头孢吡肟和氨曲南的耐药性，其耐药机制有待进一步研究。众所周知产ESBLs的菌株对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁、阿米卡星、氧氟沙星、氨苄西林/舒巴坦较敏感，对其他抗生素的敏感性均在40%以下。因此亚胺培南是治疗CTX-M型ESBLs菌所致感染最有效的药物，其次为阿米卡星和帕拉西林/他唑巴坦。因而临床用药应根据药敏结果选择合适的抗生素。

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［1］武学成，张阮章，卢月均，等.深圳地区产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌基因分型研究［J］.现代检验医学与临床，2009(3):56-59.

［2］高伟，孙震，殷俊，等.安徽省产CTX-M型超广谱B-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的耐药性与基因型研究［J］.中国抗生素杂志，2009，34(1):48 -51.

［3］卓超，苏丹红，李红玉，等.广州地区产CTX-M型超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究［J］.中华检验医学杂志，2009，32(10):1114 -1119.

［4］季淑娟，顾怡明，谭文涛，等.中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究［J］.中华检验医学杂志，2004，27(9):590-593.

［5］Zong ZY，Partridge SR，Thomas Lee，et al.Dominance of blaCTX-M within an australian extended-spectrum betalactamase gene pool［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(11):4198.

［6］Livermore DM，Canton R，Gniadkowski M，et al.CTX -M:changing the face of ESBLS in Europe［J］.J Antimicrobial Chemother，2007，59:165 -174.

［7］黎晓强，卓超.CTX-M-15型ESBLS的传播机制和基因环境的研究进展［J］.国外医药抗生素分册，2010，31(5):141-143.

［8］Bonnet R，Recule C，Baraduc R，et al.Effect of D240G substitution in a novel ESBLS CTX -M -27［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(1):29 -35.

［9］Bae IK，Lee BH，Hwang HY，et al.A novel ceftazidimehydrolysing extended- spectrum beta-lactamase，CTXM -54，with a single aminoacid substitution at position 167 in the omega loop［J］.J Antimicrob Chemother，2006，58:315-319.

CTX-M-15 gene detected in ceftazidime-resistant E.coli and Klebsiella pneumoniae isolates

LI Rui-hua1，NIE Da-ping1，HE Li-min2
(1.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Laboratory medicine institute，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

Abstract:［Objective］To investigate the relationship of CTX-M -15 gene to ceftazidime resistance of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.［Methods］CTX -M -15，CTX -M -14 genes in ceftazidime-resistant or susceptible，producing ESBL Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by Multiplex-PCR.［Results］In ceftazidimeresistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates，the total positive rate of CTX -M -15 gene was 75.9%，the positive rate of alone CTX -M -15 gene was 40.6%and the rate of co-existence of CTX -M -15，14 genes was 35.2%.In ceftazidime - susceptible Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates they were 17.7%，5.97%and 11.89%respectively.［Conclusion］CTX -M -15 gene is the major mechanism of ceftazidime resistance in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.

Key words:CTX-M-15;ceftazidime-resistant;Escherichia coli;Klebsiella pneumoniae

R378.21

A

1671-7295(2012)05-0495-04

2012-05-05;

2012-08-15

李瑞华(1972-)，女，辽宁朝阳人，副主任技师，硕士。E-mail:lrhzyp2006@yahoo.com.cn