胶原性关节炎大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平分析

宋 光，裘红梅

(大连大学医学院检验系，辽宁大连 116622)

胶原性关节炎大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平分析

宋 光，裘红梅

(大连大学医学院检验系，辽宁大连 116622)

［目的］检测血清TNF-α，IL-17及IL-10在Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠血清中的表达。［方法］建立CIA动物模型，用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测大鼠模型血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-10及IL-17的水平，同时观察大鼠炎症指数。［结果］60只大鼠随机被分为造模组(40只)和对照组(20只)，免疫4周后，造模组40只大鼠有32只发病。造模成功组大鼠血清中TNF-α、IL-17水平分别为(39.65±11.23)pg/mL和(46.1±10.9)pg/mL，明显高于造模失败组和正常对照组(P均＜0.05)，而IL-10水平(29.11±27.59)pg/mL明显低于造模失败组和正常对照组(P＜0.05)。另外，造模组大鼠血清TNF-α和IL-17水平与CIA大鼠炎症指数呈正相关关系(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，与之相反，CIA大鼠血清 IL-10水平与炎症指数呈负相关关系(r=-0.481，P＜0.05)。［结论］致炎因子(TNF-α，IL-17)和抑炎因子(IL-10)表达失衡可能在CIA发病中具有重要作用。

胶原性关节炎;TNF-α;IL-17;IL-10;关节炎症指数

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征，以慢性、对称性、多发性关节炎为主要临床表现的一种自身免疫性疾病。迄今为止RA发病机制尚未完全阐明，但很多研究表明RA动物模型在关节炎症早期存在抑炎症因子水平的降低及致炎症因子水平的升高［1-2］，即炎症因子的失衡与RA炎症过程有密切关系。本实验建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型，检测其血清中TNF-α，IL-17和IL-10水平，并观察其与炎症指标的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

Wistar大鼠60只，清洁级动物，雌性，4～6周龄，体重为(160±15)g，购于大连医科大学实验动物中心。许可证号为SCXK(辽)2002-0002。卡介苗(长春生物制品研究所产品);羊毛脂(中国嘉定华亭羊毛脂厂产品);牛Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen，CⅡ，美国Sigma公司产品)。检测大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平的ElISA试剂盒(BioLegend公司)。

1.2 动物造模

60只大鼠随机分成两组:模型组40只，正常对照组20只。具体造模如下:弗氏完全佐剂的配制［3］:将液体石蜡和羊毛脂(2∶1)于70℃水浴中充分混匀，高压灭菌(121℃、30 min)制成弗氏不完全佐剂，4℃保存。使用时，将减毒卡介苗80℃ 灭活，与弗氏不完全佐剂混匀，制成弗氏完全佐剂，卡介苗的终浓度为10 mg/mL。将牛CII溶于0.05 mol/L乙酸，并与等体积弗氏完全佐剂混合制成混悬乳剂，CII终浓度2 mg/mL。造模组大鼠每只尾根部皮内注射200 μL上述乳剂，1周后，每只大鼠接受加强免疫，尾根部皮内注射乳化CII 100 μL，诱发 CIA。对照组大鼠以相同剂量相同部位注射生理盐水。

1.3 关节炎症指数评定

采用关节分数评分法记录多发性关节炎病变的发生及严重程度，CIA关节炎症的严重程度按照以下评分标准进行，分数越高，病情越重。每个肢体最高分为4分，每只大鼠最高分为16分，记分标准分5级(0～4)，具体标准如下［4］:0分:无关节炎;1分:关节轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:严重肿胀;4分:严重肿胀且不能负重。

1.4 血清TNF-α、IL-17及IL-10水平的检测

大鼠心脏采血，离心取上清-20℃保存备用。检测血清TNF-α、IL-10、IL-17水平，具体操作按ELISA试剂盒说明进行。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 一般观察

正常对照组大鼠后腿，可观察到其表面显现正常的粉红色，脚踝无肿胀，足趾不增厚。在免疫8～12 d后，模型组大鼠开始出现症状。发病大鼠后腿可见脚踝明显肿胀，足趾明显增厚，整个后脚呈现红色或粉红色斑点。严重者可见紫色，且行走不便，不能负重。红肿逐渐消退逐渐出现关节强直、畸形以至功能障碍，表明慢性、对称性、多发性关节炎发生。40只免疫大鼠中，有32只发病明显;而对照无发病大鼠。发病大鼠活动量明显减少，食欲下降，体重低于正常组。

2.2 各组大鼠关节炎症指数评定

造模成功组关节炎指数与对照组和造模失败组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。关节炎指数随时间延长逐渐增高，免疫4周及3周较免疫后10 d关节炎症更明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

表1 不同组大鼠炎症指数的比较Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

表1 不同组大鼠炎症指数的比较Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

1)与免疫3周及4周时比较，P＜0.05;2)与造模失败组及正常对照组比较，P＜0.05

组别 n 免疫后10 d 免疫3周 免疫4周造模成功组 32 4.5 ±2.11)2)9.6 ±2.3 10.4 ±1.2造模失败组 8 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0正常对照组20 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0

2.3 各组大鼠血清细胞因子水平的测定

在免疫后的第4周，大鼠心脏穿刺采血，离心取上清，检测大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10的表达水平。与造模失败及正常对照组相比，造模成功组大鼠血清中TNF-α，IL-17的水平显著增高(P＜0.05);IL - 10水平明显降低(P ＜0.05)。见表2。

表2 两组大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比较Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

表2 两组大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比较Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

1)与造模失败组及正常对照组比较，P＜0.05

组别 TNF-α(pg/mL) IL-17(pg/mL) IL-10(pg/mL)造模成功组 39.65 ±11.231) 46.1 ±10.91) 29.11 ±27.591)造模失败组 14.33 ±4.78 5.1 ±1.2 58.78 ±15.75正常对照组10.49 ±8.53 4.2 ±1.6 59.00 ±16.85

2.4 CIA大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平与炎症指数的相关性分析

免疫4周后，造模组大鼠血清TNF-α和IL-17水平与CIA大鼠炎症指数呈正相关关系(r=0.573，r=0.492，P 均 ＜0.05)，与之相反，CIA 大鼠血清IL-10水平与炎症指数呈负相关关系(r=-0.481，P ＜0.05)。

3 讨 论

RA是以关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，致残率高。基本病理改变是滑膜炎和血管翳形成及血清组织中多种细胞因子及黏附分子等变化。其中细胞因子异常产生及其相互作用在RA关节软骨和骨质破坏过程中起重要作用。细胞因子根据其性质可分为两大类，即促炎细胞因子和抑炎细胞因子。在正常情况下，促炎因子和抑炎因子处于一个平衡状态，如有外界原因使促炎因子增加而抑炎因子的分泌减少，打破这种平衡，则会引发关节炎症。RA患者外周血单核细胞和关节滑膜液的巨噬细胞能分泌TNF-α，在关节炎症、滑膜新生血管形成及骨质破坏等病变发展中起主要作用。研究表明，TNF-α能启动和维持RA炎症免疫，在RA发病中起着中心环节的作用［5］。TNF-α单克隆抗体已经成功应用于RA患者。IL-17主要由活化的T细胞产生，促进滑膜细胞分泌多种细胞因子，具有强大的致炎作用能刺激成纤维细胞分泌 IL-6、IL-8、GM -CSF等炎症因子［6］。抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，与TNF-α协同参与骨侵蚀。IL-10是重要抗炎TH2型细胞因子，通过抑制核因子κB进而抑制Th1细胞产生TNF -α、IL -2、IFN -γ［7］;可下调抗原递呈细胞功能，抑制基质金属蛋白酶生成，抑制IL-17等致炎因子的功能和生成，从而抑制RA关节炎炎症，控制或阻止软骨及骨的破坏。

由Ⅱ型胶原诱导的实验性关节炎动物模型是研究人类RA的常用模型，本实验40只造膜组大鼠有32只关节肿胀程度严重，随着时间的推移炎症指标逐渐加重，说明造模成功。本实验发现，在关节炎大鼠血清中致炎因子TNF-α、IL-17明显升高;抑炎因子IL-10表达显著受抑;并且增高的TNF-α和IL-17与炎症指数呈正相关关系，而降低的IL-10水平与炎症指数呈负相关，说明关节炎大鼠发病过程中，细胞因子网络失调发挥重要作用，并与炎症发病有关。本研究提示对细胞因子深入研究将有助于进一步认识RA的发生机制，合理地评价RA的病情进展，为RA的免疫治疗提供科学的理论依据。

:

［1］周厚清，吴瑾滨，董敏.类风湿因子阴性类风湿关节炎患者血清抗瓜氨酸肽或蛋白抗体、IL-10及IL-18检测分析［J］.国际检验医学杂志，2011，32(13):1441-1442.

［2］Somers K，Geusens P，Elewaut D，et al.Novel autoantibody markers for early and seronegative rheumatoid arthritis［J］.J Autoimmun，2011，36(1):33 -46.

［3］Lars Klareskog，Hugh Mc Devit.Rheumatoid arthritisand it＇s animal models:the role of TNF - and the possible absenceof specific immune reactions［J］.Curr Opin Immunol，1999，1(11):657 - 662.

［4］李霞，赵彩红，裘红梅.胶原性关节炎大鼠血清中IL-17 水平的分析［J］.中国现代医学杂志，2009，19(14):2135-2137.

［5］Petrovi- Rackov L.Evaluation of the degree of clinical rheumatoid arthritis activity based on the concentrations of cytokines TNF-alpha，IL-12，IL-15，and IL-18 in serum and synovial fluid ［J］.Vojnosanit Pregl，2006，63(1):21-26.

［6］Ghilardi N，Ouyang W.Targeting the development and effectorfunctions of TH17 cells［J］.Semin Immunol，2008，19(6):383- 393.

［7］范雪亮，肖金鱼.关节炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表达的检测［J］.中国中医急症，2011，20(7):1102，1127.

Analysis of TNF-α，IL-17 and IL-10 levels in the serum of rats with collagen-induced arthritis

SONG Guang，QIU Hong-mei
(Medical Laboratory Technology，Dalian University Medical School，Dalian116622，China)

Abstract:［Objective］To investigate the serum levels of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats with type II collagen-induced arthritis(CIA).［Methods］The rat model was established using type II collagen and the serum levels of TNF - α，IL-17 and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The arthritis index in CIA rats were observed.［Results］Sixty rats were randomized into two groups:modeling group(40 rats)and normal control(20 rats).After 4 weeks，the models of CIA were established in 32 rats.The serum levels of TNF-α and IL-17 in the successful modeling group were(39.65 ± 11.23)pg/mL and(46.1 ± 10.9)pg/mL，respectively，significantly higher than that in the abortive modeling group and normal control.While serum concentration of IL -10(29.11 ±27.59)pg/mL in the successful modeling group was remarkably lower than that in the abortive modeling group and normal control(P＜0.05).In addition，There were positive correlations between TNF - α，IL -17 and arthritis index(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，negative correlations between IL -10 and arthritis index in CIA rats(r= -0.481，P＜0.05).［Conclusion］The imbalance of pro- inflammatory cytokine(TNF-α，IL-17)and anti-inflammatory cytokine(IL-10)network may be playing an important role in the pathogenesis of CIA.

Key words:collagen-induced arthritis;TNF-α;IL-17;IL-10;arthritis index

R392-33

A

1671-7295(2012)05-0492-03

辽宁省高等学校科研项目计划(L2010021)

2012-06-13;

2012-09-09

宋 光(1970-)，女，讲师，硕士。

裘红梅，高级实验师，硕士。E-mail:yxyqhm@126.com