整合子系统在非发酵菌属细菌中分布特点

肖晓光，孙国华，李 岩

(大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁大连 116011)

整合子系统在非发酵菌属细菌中分布特点

肖晓光，孙国华，李 岩

(大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁大连 116011)

［目的］了解整合子系统在非发酵菌属细菌中的分布特点，继而探讨其与非发酵菌产生多重耐药之间的关系。［方法］选取2010年7月—2011年6月由大连医科大学附属第一医院住院及门诊患者各种标本中分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱霍尔德氏菌、木糖产碱杆菌木糖亚种，提取全基因组DNA，通过PCR方法检测其整合子的携带情况，并对扩增结果进行分析。［结果］在452株铜绿假单胞菌中，I类整合子阳性检出率为41.8%;在612株鲍曼不动杆菌中I类整合子阳性检出率为66.7%，II类整合子阳性检出率为2.3%;在61株嗜麦芽窄食单胞菌中I类整合子阳性检出率为13.1%;在36株洋葱霍尔德氏菌中，I类整合子阳性检出率为8.3%;21株木糖产碱杆菌木糖亚种中未检出整合子;在以上各菌株中均没有检测到III类整合子。整合子阳性菌株和整合子阴性菌株的抗菌药物敏感性试验结果对比发现，整合子阳性的菌株对多种抗生素耐药率均高于整合子阴性菌株。［结论］整合子系统在非发酵菌属的某些菌种中检出率很高，它的存在是非发酵菌产生多重耐药的一个重要因素。

非发酵菌;多重耐药;整合子;PCR

非发酵菌属细菌是院内感染的重要病原菌。近年来，抗生素的广泛和不限制应用，导致非发酵菌属细菌的感染日趋增多，且耐药性日益严重，给临床治疗带来很大困难。近年来，非发酵菌属细菌的多重耐药性问题已逐步引起了全球范围的关注，耐药菌株的快速出现与细菌抗生素耐药基因的获得和播散密切相关［1］。目前研究发现，细菌产生耐药性的主要方式为细菌之间基因的水平传递，从而从环境中获得耐药基因，并已证实了整合子是耐药基因储存和转移的重要结构，因此对整合子的临床监测是十分必要的［2］。

非发酵菌属细菌是临床上分离阳性率较高的致病菌，且常呈多重耐药的特点，给临床抗感染治疗带来了很大的困难。因此，本研究对临床分离出的非发酵菌属细菌的整合子系统进行检测，并对其药敏结果进行分析，探讨整合子系统在非发酵菌属细菌的分布特点。

1 材料和方法

1.1 标本来源

2010年7月—2011年6月大连医科大学附属第一医院住院及门诊患者各种标本中分离所得452株铜绿假单胞菌、612株鲍曼不动杆菌、61株嗜麦芽窄食单胞菌、36株洋葱霍尔德氏菌和21株木糖产碱杆菌木糖亚种，无重复株。

阴性对照菌株:标准铜绿假单胞菌菌株(ATCC27853)，由大连市临床检验中心提供。整合子I、II、III型阳性菌株:由卫生部北京医院提供。

1.2 标本的处理及保存

实验室对标本的采集和处理均按《全国临床检验操作规程》进行。所有实验菌株均于-40℃保存。

1.3 试剂和仪器

1.3.1 试 剂:MH 琼脂、美洛培南(MEM，10 μg)纸片、米诺环素(MH，10 μg)纸片均为英国OXOID公司产品。

细菌DNA提取试剂盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)由大连宝生物公司提供。

整合子I、II、III型保守区基因扩增试剂盒为大连宝生物公司合成。

引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3.2 仪器:全自动细菌鉴定及药敏分析系统WalkAway96由美国德灵公司生产。

全自动数码凝胶图像分析仪Tanon-3500由上海天能科技有限公司生产。

基因扩增仪system9700由美国ABI公司生产。

1.4 方 法

1.4.1 非发酵菌属细菌的鉴定及药敏分析:通过全自动细菌鉴定及药敏分析系统WalkAway96，对菌株进行鉴定和进行药敏分析。

通过K-B纸片法对美洛培南和米诺环素补充药物敏感性试验。

1.4.2 整合子系统的检测:细菌DNA的提取:挑取单个菌落于1.5 mL生理盐水中，35℃孵育过夜。离心弃上清，使用由大连宝生物工程有限公司提供的细菌提取试剂盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)进行细菌基因组 DNA 的小量纯化，按照说明进行操作。

PCR扩增:PCR反应体系为:Premix Taq 25 μL，DNA 模板 3 μL，20 μmol/L 引物各 2 μL，灭菌蒸馏水 20 μL，共 50 μL。扩增条件:94℃ 5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 个循环。72℃ 10 min。

电泳:配置0.8%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm，电泳30 min。使用全自动数码凝胶图像分析仪Tanon-3500观察电泳结果。

1.5 统计学方法

通过χ2检验对各组间差异性进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各类非发酵菌属细菌临床分布情况

临床分离出2192株革兰氏阴性杆菌，各类非发酵菌属细菌临床分布情况见表2。

表2 非发酵菌属细菌的临床分布Tab 2 Clinical distribution of Nonfermenters(n=2192)

2.2 整合子PCR扩增阳性结果

整合子PCR扩增阳性结果见图1、2。

图1 整合子I PCR扩增阳性结果Fig 1 PCR positive result of int I

图2 整合子II PCR扩增阳性结果Fig 2 PCR positive result of int II

2.3 各类非发酵菌属细菌中整合子分布情况

非发酵菌中I类整合子的检出率由高到低依次为:鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱霍尔德氏菌;II类整合子只在鲍曼不动杆菌中检出;在木糖产碱杆菌木糖亚种中没有检出整合子阳性菌株。见表3。

2.4 鲍曼不动杆菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析

I、II类整合子阳性的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星、美洛培南、阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松、庆大霉素、替卡西林/棒酸的耐药率明显高于阴性组，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。见表4。

表3 各类非发酵菌属细菌中整合子检测阳性菌株分布Tab 3 Distribution of Nonfermenters integron positive species

2.5 铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析

I类整合子阳性的铜绿假单胞菌对美诺培南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星的耐药率明显高于阴性组，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。见表5。

2.6 嗜麦芽窄食单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析

I类整合子阳性的嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明、替卡西林/棒酸、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率明显高于阴性组，两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。见表 6。

2.7 洋葱伯克霍尔德菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析

I类整合子阳性的洋葱伯克霍尔德菌对头孢他啶、左氧氟沙星、复方新诺明、替卡西林/棒酸、头孢哌酮/舒巴坦均有较高的耐药率，I类整合子阴性的洋葱伯克霍尔德菌只对左氧氟沙星有较高耐药率。见表7。

表4 鲍曼不动杆菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析Tab 4 Antibiotic resistant rate of Acinetobacter baumannii

表5 铜绿假单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析Tab 5 Antibiotic resistant rate of Pseudomonas aeruginosa

表6 嗜麦芽窄食单胞菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析Tab 6 Antibiotic resistant rate of Stenotrophomonas

表7 洋葱伯克霍尔德菌整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药率分析Tab 7 Antibiotic resistant rate of Bukholdeia cepacia

3 讨论

非发酵菌属细菌多为条件致病菌，但可引起多种临床感染［3］。目前，非发酵菌属中的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌已成为重要的临床分离菌株，是引起院内感染的重要病原菌［4］。本研究中鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌在革兰氏阴性杆菌中的检出率分别为27.9%和20.6%，已经成为大连医科大学附属第一医院重要的临床分离菌。

整合子是细菌的DNA片段，是一种通过转座子或接合性质粒将多种耐药性在细菌中水平传播的耐药基因［5］。整合子存在于许多细菌中，在抗生素发现和应用前即已存在，是细菌的固有结构，在抗生素广泛应用条件下，整合子可捕获耐药基因，具有使耐药性在细菌之间传播的功能。根据整合酶基因的同源性将整合子分为3型。I型整合子在革兰阴性细菌中分布最广、检出最多［6］。I类整合子主要存在于铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌等菌属中，而Ⅱ类整合子主要存在于志贺菌属、埃希菌属、变形杆菌属、沙门菌属，不动杆菌属中也有发现。Ⅲ类整合子是在黏质沙雷菌的质粒上发现的，目前在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌中也有分离［7］。

本研究中，对本院内常见的5种非发酵菌属细菌中整合子的存在情况进行研究，结果显示，在5种非发酵菌检测中4种检出整合子的存在，其中I类整合子的检出由高到低依次为:鲍曼不动杆菌408株(66.7%)、铜绿假单胞菌 189 株(41.8%)、嗜麦芽窄食单胞菌8株(13.1%)和洋葱霍尔德氏菌3株(8.3%);II类整合子只在612株鲍曼不动杆菌中检出14株占2.3%;在木糖产碱杆菌木糖亚种中没有检出整合子阳性菌株。表明目前在本院，整合子阳性菌株在非发酵菌属细菌中已普遍存在。

在对于整合子阴性和阳性菌株的药物敏感性实验结果的分析中可以看出:整合子阳性的鲍曼不动杆菌对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药率明显高于阴性组(P＜0.05)，说明整合子阳性的鲍曼不动杆菌的可变区可能携带有aacA4-atB8-aadA1基因盒，目前研究发现该基因盒也是东北部地区常见的整合子阳性的鲍曼不动杆菌常带有的基因盒［8］。其中aacA4编码6'-N-氨基糖苷乙酰转移酶，而aadA1编码的氨基糖苷转移酶，它们是引起鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药的主要原因。

整合子阳性的铜绿假单胞则可能带有编码3-内酰胺酶，耐碳青霉烯类、氨基糖苷类、耐喹诺酮类的多种基因盒［9-10］，因此整合子阳性的铜绿假单胞菌对美诺培南、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星的耐药率明显高于阴性组(P＜0.05)。

整合子阳性的嗜麦芽窄食单胞菌携常带有sul-1/sul-2 基因盒［11］，这是引起嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明耐药的主要原因，也与本研究结果相符。

整合子阳性的洋葱伯克霍尔德菌对头孢他啶、左氧氟沙星、复方新诺明、替卡西林/棒酸均有较高的耐药率，但是对于整合子阳性的洋葱伯克霍尔德菌报道较少，所携带的基因盒尚有待于进一步研究，这也是今后主要的研究方向。

本研究还发现，对于本院整合子阳性的鲍曼不动杆菌，米诺环素和头孢哌酮/舒巴坦具有较低的耐药率;整合子阳性的铜绿假单胞菌中，头孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星具有较低的耐药率;整合子阳性的嗜麦芽窄食单胞菌中，左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素具有较低耐药率，整合子阳性的洋葱伯克霍尔德菌中，头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素具有较低耐药率。说明这些药物可作为因多重耐药引起治疗失败的非发酵菌感染中作为首选药物进行治疗。此外，本研究还发现，对于头孢他啶在非发酵菌中耐药率明显高于其它同类抗生素，其原因可能是临床对于头孢他啶的使用较多，引起耐药菌株的产生，临床因尽量减少该抗生素的使用。

本研究结果提示整合子系统的存在是非发酵菌属细菌产生耐药，乃至多重耐药和泛耐药的主要原因，这与其它报道基本一致［7］。检测基因盒-整合子系统能快速准确获得细菌多重耐药的信息，为阐明细菌耐药机制指明了方向，提供了新思路，也向临床治疗多重耐药菌提出了严峻挑战。只有慎用抗生素，才能有效避免细菌多重耐药性的发生［8-9］。

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Integron system distribution characteristic in nonfermenters

XIAO Xiao-guang，SUN Guo-hua，LI Yan
(Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To investigate the integron system distribution characteristic in nonfermenters species.［Methods］Select Multiple resistance species in Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumannii，Stenotrophomonas，Bukholdeia cepacia and Subsp xylosoxidans，which were separated from clinical from July 2010 to June 2011，and extracted their DNA，using polymerase chain reaction(PCR)method to amplify the integron and their variable zones，then analysis the result.［Results］In 452 species of pseudomonas aeruginosa，the positive rate of int I was 41.8%;In 612 species of Acinetobacter baumannii，the positive rate of int I was 66.7%;the positive rate of int I was 2.3%;In 61 species of Stenotrophomonas，the positive rate of int I was 13.1%;In 36 species of Bukholdeia cepacia，the positive rate of int I was 8.3%;we did not find int I positive species in Subsp xylosoxidans;we did not detect int III in all species.Through the susceptibility test result between the integron system positive species and the integron system negative species，we find that the resistance rate in integron system positive species are all more than in integron system negative species.［Conclusion］Resistance mediated by integron system was extensively existed in clinical isolates bacteria.It is one of the most important reasons in Multiple resistance of Nonfermenters.

Key words:nonfermenters;multiple resistance;integron;PCR

R466.1

A

1671-7295(2012)05-0487-05

辽宁省教育厅高等学校科研项目(L2010104)

2011-10-04;

2012-09-03

肖晓光(1971-)女，辽宁大连人，主任技师，硕士研究生。

孙国华，主任技师。E-mail:sgh9977@sina.com