鸡胸软骨硫酸软骨素的制备及其稳定性研究

史敏娟，熊双丽，卢 飞，王莹莹

(西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010)

鸡胸软骨硫酸软骨素的制备及其稳定性研究

史敏娟，熊双丽*，卢 飞，王莹莹

(西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010)

采用木瓜蛋白酶水解法从鸡胸软骨中提取硫酸软骨素粗多糖，并用三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀和柱色谱分离纯化得到高纯度产品。以硫酸软骨素主要成分(总糖、还原糖、葡萄糖醛酸、游离硫酸根)及相对黏度为指标，研究热、酸碱、氧化剂处理对硫酸软骨素稳定性的影响及紫外光照射对其结构的影响。研究结果表明，经紫外光照射后，硫酸软骨素结构基本无变化;在温度低于80℃，pH=7时，硫酸软骨素稳定性较好。温度大于100℃、强酸、强碱或含有氧化剂时，硫酸软骨素极不稳定，各成分变化程度较大，游离硫酸根增加，分子量降低。但对于其降解机理，需做进一步研究。

硫酸软骨素，制备，稳定性，结构

Abstract:The chicken sternal cartilage was hydrolyzed with papain.After protein was removed with trichloroacetic acid and ethanol precipitation，the crude chondroitin sulfate was purified with 732 anion chromatography and Sephacryl-300HR gel filtration chromatography in return.Then its stability with its total sugar，reducing sugar，glucuronic acid，free sulfate ions and the relative viscosity after heat，pH and oxidant treatment was studied.And its structure stability by infrared spectrum analysis after UV irradiation was studied.The results showed its basic structure had no change after UV irradiation，and it was relatively stable when temperature was lower than 80℃ and pH=7.The Chondroitin sulfate degraded when the temperature reached to 100℃，strong acid，alkaline or oxidant conditions，the ingredients varied in a wide range，the content of free sulfate ions increased and its molecular reduced.But it needed further study on its degradation mechanism.

Key words:chondroitin sulfate;preparation;stability;structure

硫酸软骨素是由D-葡萄糖醛酸(GlcpA)与N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalpA)交替连结而成的一类酸性糖胺聚糖［1］，主要存在于动物喉骨、鼻中隔、气管等软骨组织中，相对分子质量约为10000～50000u。硫酸软骨素还具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌，及降低心肌耗氧量，促进冠状动脉循环，降脂、抗凝血和防止血管硬化等生物活性，可用来治疗关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣，以及抑制泌尿系统结石等疾病［2-5］。硫酸软骨素作为添加剂，目前已被广泛应用于功能性食品、药品及化妆品，成为国内外市场上重要的生化产品。近年来，从关于硫酸软骨素构效关系和改性的研究中发现，硫酸软骨素结构的变化将导致生物活性的显著变化。目前，关于硫酸软骨素改性的研究主要集中在硫酸化硫酸软骨素(polysulfate chondroitin sulfate，PSCS)及低分子多硫酸化硫酸软骨素(low molecular weight polysulfate chondroitin sulfate)方面［6］，还有人将硫酸软骨素与金属离子如Na、Cu、Al等结合用来治疗某些疾病［7］。但在硫酸软骨素化学衍生物的制备过程中，除了目标产物的形成，热、酸碱、氧化剂等处理还会引起整个多糖的成分和结构的显著变化，但对于此方面的研究还相对较少。本实验现以硫酸软骨素主要成分(总糖、还原糖、葡萄糖醛酸、游离硫酸根)及相对黏度为指标，研究热、酸碱、氧化剂处理对硫酸软骨素稳定性的影响及紫外光照射对其结构的影响，为硫酸软骨素的提取和各种改性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鸡胸软骨 成都新太丰农业开发有限公司;木瓜蛋白酶 生化纯;葡萄糖醛酸标准品、间羟基联苯

Sigma公司;732#阳离子交换树脂 天津市科密欧化学试剂有限公司;Sephacryl-300HR Phamacia公司;其他试剂 均为分析纯。

WFJ7200型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HH-6型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;RE-52A型旋转蒸发器 海亚荣生化仪器厂;HD-2紫外检测仪 上海沪西仪器厂;红外光谱仪Nicolet-5700 美国尼高力仪器公司;乌氏毛细管相对黏度计(ø=0.5～0.6mm)。

1.2 实验方法

1.2.1 高纯度硫酸软骨素的提取、分离与纯化［8］鸡胸软骨→木瓜蛋白酶水解(55℃，6h)→10%三氯乙酸除蛋白→抽滤、离心(4500r/min，10min)→50℃真空旋转浓缩→乙醇(四倍体积工业酒精)沉淀→冰箱放置过夜→离心收集沉淀(4500r/min，10min)→透析脱盐→732#阳离子交换树脂→Sephacryl-3000HR柱层析→冷冻真空干燥→纯品、备用

1.2.2 不同处理对硫酸软骨素稳定性的影响 硫酸软骨素中主要包含葡萄糖醛酸(GlcA)，氨基己糖和硫酸根［8］，因此，以总糖、葡萄糖醛酸、还原糖、游离硫酸根及其相对相对黏度作为分析硫酸软骨素稳定性的指标。

1.2.2.1 分析方法 总糖:苯酚-硫酸法［9］;葡萄糖醛酸:间羟基联苯法［8］;还原糖:3，5-二硝基水杨酸法［9］;游离硫酸根:氯化钡-比浊法［10-11］;相对黏度:毛细管相对黏度计法(28℃)［12］。

1.2.2.2 温度对硫酸软骨素稳定性的影响 用去离子水配制浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液，在pH=6.54 的条件下，分别于 50、60、70、80、90、100℃条件下恒温水浴，每隔1h测定样品溶液中总糖、葡萄糖醛酸、还原糖、游离硫酸根含量及其相对黏度。

1.2.2.3 pH对硫酸软骨素稳定性的影响 用去离子水配制配制浓度为10mg/mL的硫酸软骨素水溶液，分别调节 pH=1、3、5、7、9、11、13，在 80℃条件下恒温水浴，每隔1h测定样品溶液中总糖、葡萄糖醛酸、还原糖、游离硫酸根含量及其相对黏度。

1.2.2.4 氧化剂对硫酸软骨素稳定性的影响 分别用浓度为1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的H2O2水溶液配制浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液，调节pH至中性，在80℃条件下恒温水浴，每隔1h测定样品溶液中总糖、葡萄糖醛酸、还原糖、游离硫酸根含量及其相对黏度。

1.2.2.5 紫外光照射对硫酸软骨素结构的影响 用254nm波长的紫外光分别照射硫酸软骨素干粉0、30、60、90min，紫外照射后，进行红外光谱分析，并与未经紫外照射的鸡胸硫酸软骨素红外图谱比较。

2 结果与分析

2.1 硫酸软骨素得率及纯度

高纯度硫酸软骨素的提取、分离与纯化［8］实验得出，木瓜蛋白酶提取率为33.51% ±0.76%，硫酸软骨素粗提物经过三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀、离子交换和凝胶层析，可得到成分相对单一的硫酸软骨素纯品，纯度高达99.09%。

2.2 不同处理对硫酸软骨素稳定性的影响

2.2.1 温度对硫酸软骨素稳定性的影响 图1～图5表示在pH=6.54时，不同温度、不同时间条件对硫酸软骨素稳定性的影响。

图1 温度对总糖含量的影响Fig.1 Effect of the temperature on the content of the total sugar

图2 温度对还原糖含量的影响Fig.2 Effect of the temperature on the content of the reducing sugar

图3 温度对葡萄糖醛酸含量的影响Fig.3 Effect of the temperature on the content of the glucuronic acid

图4 温度对游离硫酸根含量的影响Fig.4 Effect of the temperature on the content of the free sulfate ions

图1和图3显示，硫酸软骨素总糖含量低于葡萄糖醛酸含量，这是因为总糖含量是在490nm波长处测定，硫酸软骨素中含有30%左右的葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，而葡萄糖醛酸和氨基己糖的最大吸收均不在490nm，因此造成总糖含量测定偏低。

图5 温度对相对黏度的影响Fig.5 Effect of the temperature on the relative viscosity

由图1～图5可以看出，随着温度升高，时间延长，总糖含量逐渐下降，葡萄糖醛酸、还原糖和游离硫酸根含量逐渐上升，相对黏度也逐渐增大，但在100℃后开始减小。这些结果表明，硫酸软骨素耐热性较好，但超过100℃，耐热性降低，其中硫酸基团的热稳定性较差，而糖醛酸键的热稳定性则相对较好。这可能是由于多糖发生热降解所致，大分子多糖降解成小分子多糖，还有部分多糖降解成单糖。这样的影响主要与多糖的成分、热处理的温度和时间有关。以上结果表明，加热温度低于80℃，6h以内硫酸软骨素多糖具有相对理想的稳定性。因此，对硫酸软骨素的改性和加工最好控制在80℃范围内。

2.2.2 pH对硫酸软骨素稳定性的影响 图6～图10表示在80℃恒温条件下，不同pH、不同时间条件对硫酸软骨素稳定性的影响。

图6 pH对总糖含量的影响Fig.6 Effect of the pH on the content of the total sugar

图7 pH对还原糖含量的影响Fig.7 Effect of the pH on the content of the reducing sugar

图8 pH对葡萄糖醛酸含量的影响Fig.8 Effect of the pH on the content of the glucuronic acid

图9 pH对游离硫酸根含量的影响Fig.9 Effect of the pH on the content of the free sulfate ions

图10 pH对相对黏度的影响Fig.10 Effect of the pH on the stability relative viscosity

由图6～图10可以看出，随着pH增大，时间延长，总糖和葡萄糖醛酸含量逐渐减少，游离硫酸根含量逐渐增大;在偏离中性条件下，偏离越多，还原糖含量减少，相对黏度降低，尤其在pH≤1和pH≥13条件下，随着时间延长，还原糖含量和相对黏度急剧降低。这可能是由于在强碱条件下，还原糖被氧化，强酸条件下，多糖分子可能发生解聚，或者羧基被解离，分子带有较多的负电荷，产生较大的静电排斥力，使之不易聚集，因而聚集体显著减小，从而导致溶液相对黏度降低［13］。同时，在pH≤1和pH≥13的强酸碱条件下，多糖的分子结构也可能会发生变化。总体来说，在温度为80℃、pH=7条件下，硫酸软骨素稳定性较好，因此可在80℃，中性环境条件下，对硫酸软骨素进行改性和加工利用。

2.2.3 氧化剂对硫酸软骨素稳定性影响 图11～图15表示在80℃恒温条件下，不同浓度氧化剂、不同时间条件对硫酸软骨素稳定性的影响。

由图11～图15中可以看出，随着氧化剂H2O2浓度增大，时间延长，硫酸软骨素中总糖、还原糖、葡萄糖醛酸含量逐渐降低，游离硫酸根离子逐渐增多，溶液相对黏度逐渐减小，当H2O2浓度4.5%时，还原糖在1h内被氧化完全。可见，在氧化剂H2O2条件下，硫酸软骨素多糖极不稳定。这可能是由于在强氧化剂作用下，多糖分子结构发生改变所致。葡萄糖醛酸显色反应中，显色剂间羟基联苯可能被氧化剂H2O2氧化成碳，溶液呈黑色，影响葡萄糖醛酸与间羟基联苯反应，导致糖醛酸实验结果偏小。在氧化剂H2O2条件下，总糖含量增加，前3h高达50%左右，这可能是由于氧化剂的作用使多糖糖苷键发生断裂，使大分子多糖降解为许多小分子多糖。

图11 氧化剂对总糖含量的影响Fig.11 Effect of the oxidant on the content of the total sugar

图12 氧化剂对还原糖含量的影响Fig.12 Effect of the oxidant on the content of the reducing sugar

图13 氧化剂对葡萄糖醛酸含量的影响Fig.13 Effect of the oxidant on the content of the glucuronic acid

图14 氧化剂对游离硫酸根含量的影响Fig.14 Effect of the oxidant on the content of the free sulfate ions

2.3 紫外光对硫酸软骨素结构的影响

图15 氧化剂对相对黏度的影响Fig.15 Effect of the oxidant on the relative viscosity

图16 紫外光照射不同时间后鸡胸硫酸软骨素的红外光谱图Fig.16 Infrared spectrum of chondroitin sulfate from chicken sternal after different UV irradiation time

图16为紫外光(254nm)照射0、30、60、90min 后鸡胸硫酸软骨素红外光谱图。比较图谱发现，在3200～3600、2800～3000、1650、1556、1375～1420、1238～1256和855.25cm-1处出现的鸡胸硫酸软骨素的特征吸收峰基本无变化，紫外光照射后的鸡胸硫酸软骨素红外光谱与熊双丽等［14］报道的鸡胸硫酸软骨素红外光谱吸收曲线基本一致。说明鸡胸硫酸软骨素结构对紫外光不敏感，经过紫外光处理后的鸡胸硫酸软骨素结构基本无变化。

3 结论

通过酶提醇沉柱分离的方法从鸡胸软骨中可以分离得到纯度较高的硫酸软骨素，纯度高达99.09%。以硫酸软骨素的主要成分(总糖、还原糖、葡萄糖醛酸、游离硫酸根)及相对黏度为指标，研究在不同温度、酸碱、氧化剂浓度条件下硫酸软骨素稳定性的影响及紫外光照射对其结构影响。其中相对黏度可以间接反映分子量大小，生物活性多糖的生物活性往往与其分子量密切相关。研究结果表明，254nm波长的紫外光照射对硫酸软骨素结构基本无影响;处理温度、pH和氧化剂都对硫酸软骨素多糖产生一定影响。加热温度低于80℃、pH=7的中性条件下，总糖含量16%、葡萄糖醛酸含量25%左右，游离硫酸根含量低于1%，表明此条件下，硫酸软骨素稳定性相对较好，可在此条件下对硫酸软骨素进行改性和加工利用。温度大于100℃，随着时间的延长，葡萄糖醛酸和游离硫酸根含量增加，相对黏度减小;pH≤1和pH≥13的强酸、碱条件下，总糖含量相对不变，游离硫酸根含量增加，还原糖含量和相对黏度降低，表明此条件下硫酸软骨素极不稳定，会发生一定程度降解，导致硫酸软骨素结构发生变化;氧化剂条件下，硫酸软骨素总糖含量高达50%左右，表明氧化剂可引起多糖糖苷键发生断裂，使多糖分子结构发生变化。

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Preparation and stability study of chondroitin sulfate from chicken sternal cartilage

SHI Min-juan，XIONG Shuang-li*，LU Fei，WANG Ying-ying
(College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

TS251.1

B

1002-0306(2012)12-0328-05

2011-10-14 *通讯联系人

史敏娟(1987-)，女，硕士研究生，研究方向:食品应用化学。

绵阳市科技局项目(10Y004-1)。