枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质对鱼丸的保鲜作用

南 楠，戚向阳，袁勇军

(1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070;2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100)

枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质对鱼丸的保鲜作用

南 楠1，戚向阳2，*，袁勇军2

(1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070;2.浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100)

为了研究抗微生物肽在水产制品保鲜方面的应用，该文探讨了枯草芽孢杆菌WL17产抗菌肽对鱼丸贮藏过程中菌落数、硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid，TBA)、挥发性盐基氮值(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)、硬度、弹性和咀嚼性的影响。结果表明:当抗菌物质添加浓度为2mg/g时，可使鱼丸的菌落数下降1.23个数量级，TBA值和TVB-N处于较低水平，而其质构特性没有大的变化，且与乳酸链菌肽(Nisin)的保鲜效果相当。结果表明枯草芽孢杆菌WL17产抗菌物质对鱼丸具有较好的保鲜效果。

枯草芽孢杆菌WL17，抗菌物质，鱼丸，保鲜

Abstract:In order to guide the application of antimicrobial substances from Bacillus subtilis WL17 in the preservation of aquatic products，effects of adding different concentrations of antimicrobial substances obtained from Bacillus subtilis on the bacterial count，TBA value，TVB-N value，hardness，springiness，cohesiveness of fishball during storage process were studied.Results showed that antimicrobial substances at a concentration of 2mg/g caused 1.23lg cfu/g reduction of the microbial count，whereas the TBA value and TVB-N value were both at the low-level with no significance texture change of fish-ball.The experiments showed the preservation effect on the fish-ball after adding 2mg/g antimicrobial substance was the same as nisin，which indicated the antimicrobial substance obtained from Bacillus subtilis had a good preservation effect on fish-ball.

Key words:Bacillus subtilis WL17;antimicrobial substance;fish-ball;preservation

随着我国速冻行业的快速发展，备受人们喜爱的鱼丸制品的需求量不断增加，但由于鱼丸制品蛋白含量高、营养丰富，在贮藏的过程中极易腐败变质。有研究显示鱼丸在4℃左右冷藏的保质期一般在一周左右［1-2］。采用高压灭菌或冻藏保鲜不但会导致鱼丸组织构造的破坏，而且会增加企业的能耗成本。因此，使用生物保鲜技术不失为一种好的选择，目前我国允许使用的天然生物保鲜剂只有乳酸链菌肽(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)两种，已经广泛应用于食品的防腐保鲜［3-6］。由于生物保鲜物质在达到防腐保鲜目的的同时，还不会造成食品的毒素污染，而且有些生物保鲜剂本身就是食品中的某种营养成分。因此，开发高效安全的天然食品防腐剂已成为食品添加剂发展的主要方向。在前期的研究中，我们发现枯草芽孢杆菌WL17代谢合成的抗菌物质对食品致病菌和腐败菌都有很好的抑制效果，本研究将进一步探讨抗菌物质对新鲜鱼丸的保鲜效果，为其在实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲢鱼及辅料 沃尔玛超市;枯草芽孢杆菌WL17本实验室保存;Nisin 分析纯，浙江银象生物工程有限公司;2-硫代巴比妥酸 分析纯，上海卓康生物科技有限公司;营养琼脂培养基、蛋白胨及酵母膏分析纯，杭州微生物试剂有限公司;牛肉膏 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

BILON-8型均质机 上海比朗;CT3型质构仪美国Brookfield公司;SPX型智能生化培养箱 宁波江南仪器厂;754型紫外可见分光光度仪 上海菁华科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼丸的制作工艺 鲜鲢鱼→洗净→采肉→漂洗→脱水→精滤→排斩→调料→成型→水煮→冷却→包装

辅料配方(g):鱼肉100，取食盐3，淀粉20，砂糖2，味精 0.8，水30。

1.2.2 枯草芽孢杆菌WL17抗菌活性物质的制备取斜面菌种一环到种子培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水1000mL，pH=7.0～7.4)中，37℃，160r/min，培养 18h后，按照3%的接种量接入装有100mL发酵培养基(葡萄糖11g，MgSO40.5g，L-谷氨酸钠 5g，KCl 0.5g，KH2PO41.0g，FeSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸馏水1000mL，pH=6.91)的500mL 三角瓶中，28℃，160r/min，发酵培养32h。发酵液在4℃下离心15min(8000r/min)去菌体得到上清液，上清液用6mo1/L的HCl调pH为2.5，4℃下沉淀1h。然后以10000r/min的转速低温离心15min，收集沉淀物，用70%甲醇溶解提取三次，收集提取液并将其pH调为中性，旋转蒸发除去甲醇后真空冷冻干燥可得到粗提物，分析表明其对食品常见致病菌和腐败真菌具有较好的抑菌活性。

1.2.3 抗菌物质对鱼丸保鲜效果的研究 在鱼丸制作过程中添加不同含量的抗菌物质，使其最终浓度分别为 0、0.5、1.0、2.0、3.0mg/g，另外将添加 0.3mg/g nisin的鱼丸作为阳性对照组。鱼丸制成后立即用无菌食品保鲜袋密封包装，将样品放置于4℃下储藏，定期对鱼丸的细菌总数、TBA值、TVB-N值、硬度、弹性和咀嚼性指标进行检测。检测随机抽3袋，结果取平均值。

1.2.4 细菌总数的测定 在无菌操作台内，称取样品10g，置于90mL无菌生理盐水中，充分均质后，做成1∶10的稀释液，按GB 4789.2-2010规定的方法进行稀释平板计数。

1.2.5 硫代巴比妥酸值(TBA)的测定［7］取10g样品斩碎均匀后，加50mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA)，振摇30min，双层滤纸过滤两次。取5mL上清液，加入5mL 0.02mol·L-12-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴中保温40min，取出冷却1h后，以1600r/min离心5min，上清液中加5mL氯仿摇匀，静置分层后取上清液，分别在532nm和600nm处比色，记录消光值并用以下公式计算TBA值。

1.2.6 挥发性盐基氮值(TVB-N)的测定 取10g样品斩碎均匀后，置于锥形瓶中，添加蒸馏水50mL，振摇后浸渍30min，过滤，取滤液按GB 5009.44-2003微量扩散法测定，标准盐酸浓度为0.0lmol/L。

1.2.7 质构特性的测定 鱼丸切成长1.5cm，宽1cm大小的长方体，用CT3质构仪进行分析。设定参数:测量前探头下降速度5.0mm/s，测试速度0.5mm/s，测量后探头回程速度0.5mm/s，针入距离6mm。触发力值5g，探头类型p/5。

1.2.8 抗菌物质的HPLC分析 抗菌物质粗提物用甲醇溶解，经0.45μm有机滤膜过滤后进行 HPLC分析。

HPLC分析条件如下:流动相:含0.1%三氟乙酸的乙腈(A)和纯水(B)，洗脱过程:0～100%(A)，0～60min，100% ～0(B)，0～60min，流速为 1.0mL/min，检测波长230nm。

1.2.9 数据统计分析 采用SAS 8.2软件对实验数据进行方差分析。当p＜0.05时，表示差异显著，当p＞0.05时，表示差异不显著。所有实验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度的抗菌物质对鱼丸贮藏品质的影响

2.1.1 抗菌物质添加浓度对细菌总数的影响 含有不同添加量抗菌物质的鱼丸在贮藏程中的细菌总数变化如图1所示。鱼糜制品卫生标准(GB10132-2005)规定，非即食类鱼糜制品细菌总数不得超过5×104cfu/g。从图1可以看出，随着贮藏时间的延长，细菌总数不断增加，添加抗菌物质可以明显抑制细菌的生长，且添加的浓度越高，抑制效果越好。未添加抗菌物质的鱼丸在第16d其菌落数已达到5.66lg cfu/g，且表面发粘出现感官腐败现象，而抗菌物质添加浓度分别为2mg/g和3mg/g的鱼丸其菌落数为4.43lg cfu/g和4.32lg cfu/g，添加nisin的阳性组其菌落数为4.57lg cfu/g。表明所添加的抗菌物质与nisin均可有效延长鱼丸的保藏时间。

方差分析表明，添加不同浓度抗菌物质的样品组之间的抑菌活性具有显著性差异(p＜0.005)。多重比较显示，与对照组相比，添加浓度分别为2、3mg/g的样品组(p＜0.001)及添加nisin的阳性组(p＜0.05)均存在显著性差异，但这三组样品之间的抑菌活性无显著性差异，说明所制备的抗菌物质在鱼丸储藏过程中能够有效地抑制微生物的生长，且以添加量2mg/g时效果最佳。

图1 不同添加量的抗菌物质对鱼丸贮藏过程中细菌总数的影响Fig.1 Effect of antimicrobial substance concentrations on the total bacterial count of fish-ball during storage

2.1.2 抗菌物质添加浓度对TBA值的影响 添加不同量抗菌物质的鱼丸在贮藏过程TBA值的变化如图2所示，随着贮藏时间的延长，TBA值呈缓慢上升态势。但添加抗菌物质以及nisin的样品后，其TBA值在不同贮藏时间整体上小于空白对照组，添加浓度分别为2mg/g(p＜0.01)和3mg/g(p＜0.01)的样品组与空白对照组相比有极显著差异，表明枯草芽孢杆菌WL17抗菌物质具有一定的抗氧化活性，可有效抑制鱼丸中脂质的氧化。

图2 抗菌物质添加量对鱼丸贮藏过程中TBA值的影响Fig.2 Effect of antimicrobial substance concentrations on the TBA of fish-ball during storage

2.1.3 抗菌物质添加浓度对TVB-N值的影响 TVB-N值反映水产品中的蛋白质在酶和细菌的作用下，发生分解而产生氨和胺等碱性含氮物的情况，是国标中用于评价肉质鲜度的唯一理化指标，其值越低，鱼丸的新鲜度越高。由图3可知，随着贮藏时间的延长，TVB-N值不断增大。到第16d，空白对照组的TVB-N值已达到3.23mg/100g，且出现发粘变质现象。而其它添加了不同浓度抗菌物质以及nisin的样品组其TVB-N含量均低于3.0mg/100g。

多重比较表明，抗菌物质添加浓度分别为2mg/g(p＜0.05)和3mg/g(p＜0.05)的样品组其TVB-N值与空白组相比有显著性差异，但与nisin样品组相比无显著性变化，表明所制备的抗菌物质能够有效控制TVB-N值，达到保鲜目的。

图3 抗菌物质添加量对鱼丸贮藏过程中TVB-N值的影响Fig.3 Effect of antimicrobial substance concentrations on the TVB-N of fish-ball during storage

2.1.4 抗菌物质添加浓度对硬度、弹性和咀嚼性的影响 鱼丸制品的弹性是赋予制品独特口感的重要特征，不仅在食味上，而且对制品的外观、贮藏性也有较大的影响，硬度太低或太高都不利于鱼丸的弹性。如图4、图5所示，添加抗菌物质的鱼丸与空白组相比硬度(p＜0.01)和弹性(p＜0.01)都有显著性差异。在贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，鱼丸的硬度逐渐增加，弹性逐渐减弱。这可能是因为鱼丸蛋白质发生变性失水，造成由肌动球蛋白溶胶凝固形成的网状结构聚集，从而导致鱼丸硬度上升弹性下降。而添加抗菌物质的鱼丸在硬度和弹性方面均优于空白对照组，这可能是因为抗菌物质主要为多肽类分子，能够与蛋白质络合使其网状结构相对稳定。

添加抗菌物质的鱼丸贮藏过程中咀嚼性的变化如图6所示，处理组与对照组相比咀嚼性没有显著差别(p＞0.05)，说明添加的抗菌物质对鱼丸的咀嚼性没有太大影响。

图4 抗菌物质添加量对鱼丸贮藏过程中硬度的影响Fig.4 Effect of antimicrobial substance concentrations on the hardness of fish-ball during storage

图5 抗菌物质添加量对鱼丸贮藏过程中弹性的影响Fig.5 Effect of antimicrobial substance concentrations on the springiness of fish-ball during storage

图6 抗菌物质添加量对鱼丸贮藏过程中咀嚼性的影响Fig.6 Effect of antimicrobial substance concentrations on the cohesiveness of fish-ball during storage

2.1.5 品质变化指标的相关性分析 对添加不同抗菌物质含量鱼丸的菌落数、TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的变化与贮藏时间进行相关性分析，结果见表1。由表1可以看出，菌落数、TBA值和TVB-N值与贮藏时间存在良好的正相关性(r＞0.9)，弹性与鱼丸成一定程度的负相关。

菌落数与各指标的相关性分析如表2所示，所有样品的菌落数与TBA和TVB-N值均具有很好的正相关性，随着贮藏时间的延长，菌落总数的增加，TBA和TVB-N值也迅速增加。这与相关报道相一致［2，8］。微生物的生长会促进鱼丸的氧化酸败，抗菌物质的添加可有效抑制微生物的生长，降低微生物降解蛋白质等营养成分的速率，延缓挥发性盐基氮值的增大，另外抗菌物质主要为多肽类物质，可能本身也具有抗氧化活性，也在一定程度上抑制了鱼丸的氧化酸败，所以，对于添加了不同浓度抗菌物质的样品，其菌落数均与TVB-N值和TBA值呈正相关。

表1 贮藏时间与菌落数、TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的相关性分析Table 1 Correlation analysis between storage time and bacterial count，TBA，TVB-N，hardness，springiness and cohesiveness

表2 菌落数与TBA、TVB-N、硬度、弹性和咀嚼性的相关性分析Table 2 Correlation analysis between bacterial count，TBA，TVB-N，hardness，springiness and cohesiveness

2.2 抗菌物质的HPLC分析

由抗菌物质的HPLC分析可知(见图7)，其包含多种组分，色谱峰主要集中在30～40min、47～55min和57～60min三个区域，说明抗菌物质中可能存在三大类性质相似的抗菌物质。有研究报道枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生surfactin，而有些菌株却能同时产 生 surfactin、fengycin 和 iturin或 surfactin、bacillomycin和plipastatin。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成［9］，还有研究显示枯草芽孢杆菌还能产生一些多烯类物质及其多肽类物质［10-11］，具有很好的抗细菌活性。本研究小组在前期研究中也发现枯草芽孢杆菌WL17产生的抗菌物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都具有出色的抑制能力。因此，结合各种抗菌物质的抑菌特性及有关文献［12-16］，可以推测枯草芽孢杆菌WL-17能够产生多种不同分子量、不同结构类型的抗菌物质，对细菌和真菌都具有较好的抑制作用，但有关其主要抗菌物质的结构、性质、构效关系以及相关机制等还有待于进一步深入探讨。

3 结论

化学防腐剂安全隐患的存在以及食品安全意识的提高，致使人们对不含化学防腐剂的天然、绿色食品的需求日益增大，开发高效安全的天然防腐剂对我国食品工业的发展具有重大意义。本次实验结果表明，在鱼丸中添加枯草芽孢杆菌WL17产生的抗菌物质能够显著地抑制微生物的生长，延长鱼丸的保质期。当鱼丸中抗菌物质的添加浓度为2mg/g时，其保鲜效果最佳，可使菌落数降低1.23个数量级，TBA值和TVB-N值与对照组相比上升缓慢，鱼丸的质构特性也没有显著的变化，且与nisin的保鲜效果相当。因此，抗枯草芽孢杆菌WL17产生的抗菌物质作为一种天然防腐剂具有很好的开发价值。

图7 抗菌物质粗提物HPLC色谱图Fig.7 HPLC chromatograms of antimicrobial crude extract

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Effect of antimicrobial substance from Bacillus subtilis WL17 on preservation of fish-ball during storage

NAN Nan1，QI Xiang-yang2，*，YUAN Yong-jun2
(1.Food Science and Technology Department，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;2.Faculty of Bioscience and Environmental Science，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China)

TS254.4

A

1002-0306(2012)12-0353-05

2011-08-30 *通讯联系人

南楠(1984-)，男，硕士研究生，研究方向:天然产物化学功能成分的研究。

浙江省科技厅面上项目(2009C32017)。