芳香植物广陈皮和山奈中有翅桃蚜驱避物质的化学鉴定

李为争，庄 丽，付国需，杨 雷，李慧玲，原国辉

河南农业大学植物保护学院，郑州 450002

桃蚜Myzus persicae(Sulzer)又称烟蚜，是一种常年发生危害严重的世界性害虫。文献记载的桃蚜寄主植物多达400余种［1］，且可传播100多种植物病毒［2］。20世纪80年代以来，为了有效控制桃蚜的危害，化学杀虫剂的使用日趋频繁，单位面积的用药量不断攀升，导致桃蚜对多种杀虫剂产生了抗药性，同时也引发了农产品质量安全问题［3］。因此，寻求桃蚜无公害控制的新技术与新途径受到了广泛关注，其中利用行为调控物质控制有翅蚜向作物田的迁移、降落和定殖等生命行为，不仅可以减轻蚜虫的危害，而且能够抑制病毒病的发生［4-5］。如严建新和侯有明研究发现，芳香植物细叶桉Eucalyptus tereticornia的乙醇提取物对桃蚜的驱避率高达94.17%［6］;Hori研究了13种唇形科芳香植物精油对于桃蚜的驱避效果，发现迷迭香Rosmarinus officinalis和千里香Thymus seryllum精油在1 μL剂量时即具有驱避作用，在迷迭香精油弥散的烟草田，桃蚜种群数量比对照烟草田下降70%左右，表明非寄主植物气味影响桃蚜在寄主植物上的降落过程，具有防治应用的潜力［7］。

然而，系统筛选活性芳香植物，并通过序贯性化学分析和生物测定，最终从植物源中找到的活性化合物仍然十分有限。迄今为止，仅发现水杨酸甲酯是对蚜虫具有广谱驱避性的物质［8-10］。本课题组此前测定了30种常见芳香植物材料对有翅桃蚜的驱避活性，发现姜科的山奈Kaempferia galanga和芸香科的广陈皮Citrus chachiensis粉末的驱避活性比水杨酸甲酯更强［4］。为了探明其中的驱避活性成分，本文采用柱层析、GC-MS等技术鉴定了这些材料中的主要驱避活性成分，并研究了这些活性成分之间的相互作用，期望为桃蚜高效驱避剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫和材料

供试昆虫为桃蚜，在春季迁飞高峰期，从河南农业大学科教园区的桃园采集有蚜桃叶，放置在市售黄盘中，使有翅桃蚜自由分散;测定前用软毛刷收集离开桃叶在黄盘中自由活动的有翅桃蚜，放入铺有湿沙的8 mL玻璃小瓶内，每瓶30头，饥饿5 h后用于测定。供试材料为广陈皮和山奈，均购买于郑州黄河小商品市场，经自然干燥后用FW-100型高速万能粉碎机在1200 rpm的转速下粉碎10 s，过40目筛，密封于Parafilm保鲜袋中备用。供试试剂D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯购买于苏州亚科化学试剂股份有限公司，纯度分别为90%和98%，柱层析用的有机溶剂乙醚和石油醚购买于天津科密欧试剂公司，分析纯。

1.2 仪器设备

生物测定装置为二项选择式Y形嗅觉仪，主臂长20 cm，支臂长15 cm，内径为2 cm，两个支臂之间的夹角为60°，全套装置采用1 cm ID的Teflon管进行连接。索氏提取器由上海亚荣化玻仪器公司生产。广陈皮和山奈活性馏分所用分析仪器为DSQⅡ型气相色谱-质谱联用仪，配置DB-5 ms毛细柱(30 m × 0.25 mm)。

1.3 生物测定

生物测定在室温22±4℃的室内条件下进行，测定时间为每日10∶00～16∶00。测定时将处理样品和对照样品滴加在滤纸上，并放置在与Y形嗅觉仪两支臂的一侧相连的100 mL三角瓶中，两支臂空气入口接活性碳空气净化装置，然后取收集于小瓶中的桃蚜30头快速接入Y形嗅觉仪的主臂入口处，打开抽气机，气流速度控制在0.3 L/min。并将整套装置遮黑处理，20 min后观察记录进入处理支臂和对照支臂的桃蚜数量，进入支臂10 cm的个体视为做出了行为选择反应。每次测定完成后，取出所有离心管，用电吹风机均匀吹扫Y形嗅觉仪中残余的气体，将两支臂位置调换，更换材料和蚜虫后再进行下次测定。为避免学习经历对试验结果可能造成的影响，每次测定均使用新挑取的蚜虫。按下式计算不同处理对桃蚜的驱避率(Repellent percentage，Rp):

式中:Rp为驱避率，CK为对照区的桃蚜数量，Tr为处理区的桃蚜数量，采用SAS软件的配对t测验分析两支臂桃蚜分布数量的差异显著性。采用Trisyono＆Whalon给出的卡方检验公式判断二元混合物的拮抗、加成或增效作用［11］。

1.4 广陈皮和山奈索氏提取物梯度混合测试

分别称取广陈皮和山奈粉末30 g用80目不锈钢纱网包裹，放入索氏提取器中用重蒸二氯甲烷提取，热源温度为42℃，发生5次虹吸后拆除装置，将提取液放入旋转蒸发仪中50℃下减压浓缩至再无废液滴下为止。广陈皮精油得率为3.541%，山奈精油的得率为2.446%。分别用正己烷稀释淋洗蒸馏瓶中的浓缩物，并定容到10 mL，用于进一步的生物活性检验和柱层析分离。测定时，将广陈皮和山奈的提取物按不同的体积比配制成20 μL的样品，滴加在滤纸条上作为气味源，混合样品(广陈皮∶山奈，v/v)的比例如下:20∶0、18∶2、16∶4、14∶6、12∶8、10∶10、8∶12、6∶14、4∶16、2∶18、0∶20，共 11 个处理，分别与洁净空气组成配对置于Y形嗅觉仪中进行生物测定，每种混合样品重复测定8次。

1.5 柱层析步骤

将Florisil粉在200℃下干燥2 h，冷却至室温后与60～90沸程的石油醚混合，填充到50 cm ×1 cm ID的层析柱柱高的2/3处，取广陈皮或山奈提取物5 mL缓慢滴加到层析柱中，依次取石油醚和乙醚梯度混合溶剂(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)进行淋洗，每次淋洗 10 mL，收集后分别取每馏分20 μL作为气味源置于Y形嗅觉仪中，与洁净空气配对进行测定，每个馏分重复测定6次。

1.6 D-柠檬烯及反-对甲氧基肉桂酸乙酯的活性测定和相互作用分析

由于柱层析过程使两种植物粗提物中的化学成分发生了再分配，广陈皮活性馏分的主要成分D-柠檬烯和山奈活性馏分的主要成分反-对甲氧基肉桂酸乙酯在原材料中的含量难以估计。因此直接取D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯进行驱避活性测定。分为2 μL D-柠檬烯、2 mg反-对甲氧基肉桂酸乙酯、1 μL D-柠檬烯 +1 mg反-对甲氧基肉桂酸乙酯共3组样品，溶于20 μL正己烷中作为气味源，每个处理重复测定10次。

1.7 GC-MS 分析

广陈皮活性馏分分析条件:GC进样口250℃，分流比10∶1;柱初温80℃，保留3 min，然后以15℃/min升至240℃，保留15 min;山奈活性馏分分析条件为:进样口280℃，柱初温80℃，保留1 min，以20℃/min升至250℃，保留25 min。离子源温度为250℃，界面温度为250℃，扫描范围33～400 amu，碎片离子与NIST质谱库比较确定化合物的结构。

2 结果与分析

2.1 广陈皮和山奈索氏提取物对桃蚜驱避的相互作用测定

不同体积比的广陈皮和山奈索氏提取物对桃蚜的驱避率如图1所示。不同体积比的混合粗提物对桃蚜的驱避百分率之间没有显著性差异(F=0.94，F0.05=1.96)，但单纯的广陈皮粗提物(20/0)和单纯的山奈粗提物对桃蚜的驱避率分别达59.42%和65.71%左右，与相应的天然材料粉末的驱避率相当，说明采用索氏提取器和旋转蒸发仪的处理过程没有使活性成分损失，提取、浓缩采用的条件是适当的。随着2种提取物成分的杂化，对桃蚜的驱避百分率逐渐下降，以10/10等量混合的样品对桃蚜的驱避活性最低(37.5%)，说明广陈皮和山奈的提取物可能存在着加成作用或微弱的拮抗作用。

图1 不同体积比的广陈皮和山奈提取物对桃蚜的驱避率Fig.1 Repellence of different volume ratios of C.chachiensis and K.galanga extracts to M.persicae

2.2 广陈皮和山奈柱层析产物生物活性测定

广陈皮和山奈柱层析分离产物的生物测定结果见表1和表2。从表1可以看出，广陈皮洗脱液中，仅馏分Fr.8对桃蚜具有极显著驱避活性(t=5.18，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，驱 避 率 达 到33.33%，低于图1中广陈皮粗提物单独使用对桃蚜的驱避活性，可能与柱层析过程稀释了原始浓缩物有关。从表2可以看出，在山奈洗脱液中，馏分Fr.6对桃蚜具有较强的驱避活性，驱避率达到43.75%(t=6.74，t0.05=2.57;t0.01=4.03);另外馏分 Fr.4和Fr.9也具有显著的驱避活性，驱避率分别达到26.26%和18.89%。馏分Fr.8表现为微弱的引诱活性，且也达到了显著性水平(t=3.48，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，说明山奈驱避桃蚜的挥发性物质可能是一组极性差别较大的混合物，且有可能与引诱物质共存于同一材料，驱避反应的行为输出是桃蚜对这些复杂混合物进行综合评判的结果。

表1 广陈皮柱层析洗脱液不同馏分对桃蚜的驱避活性Table 1 The repellent activities of the C.chachiensis fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether

表2 山奈柱层析洗脱液不同馏分对桃蚜的驱避活性Table 2 The repellent activities of K.galanga fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether.

2.3 广陈皮和山奈活性洗脱液GC-MS分析

取广陈皮提取物中具有驱避活性的馏分Fr.8进行GC-MS分析，总离子流图和成分列表分别见图2和表3。从表3可以看出，广陈皮活性洗脱液中共鉴定出9种成分，含量最大的是芸香科的特征性挥发物D-柠檬烯(39.07%)，其次是对异丙基-1-甲基苯乙醛(21.86%)，二者合计占总挥发物成分的61%左右，其他成分所占比例较低。取山奈提取物中具有驱避性的馏分 Fr.6、Fr.4和 Fr.9合并起来进行分析，总离子流图和成分列表分别见图3和表4。从表4可以看出，山奈活性馏分中共鉴定出21种成分，含量最大的是姜科植物的特征性挥发物反-对甲氧基肉桂酸乙酯(70.22%)和顺-对甲氧基肉桂酸乙酯(19.55%)，这两种顺反异构体合计占总挥发物量的89.77%。推测D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯可能具有驱避桃蚜的活性。但由于柱层析过程中化学成分在不同馏分之间发生了再分配， 这些主成分在原始材料提取物中的含量是未知的。

图2 广陈皮活性洗脱液GC-MS分析总离子流图Fig.2 Total ion chromatography of the active fractions of C.chachiensis extracts

表3 广陈皮活性洗脱液GC-MS成分鉴定结果Table 3 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the C.chachiensis active fractions analyzed by GC-MS

图3 山奈活性洗脱液总离子流图Fig.3 Total ion chromatography of active fractions of K.galangal extracts

表4 山奈活性洗脱液GC-MS分析结果Table 4 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the K.galanga active fractions analyzed by GC-MS

图4 D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯及其二元混合物对桃蚜的驱避活性测定Fig.4 Repellence bioassay of D-limonene，ethyl 4-methoxycinnamate，and their binary blend to M.persicae

2.4 广陈皮和山奈活性馏分的主要成分驱避活性测定

由于鉴定出的多种物质难以购置，且D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯分别是广陈皮和山奈的主要挥发物成分，因此仅测试了这两种成分对桃蚜的驱避作用，结果如图4所示。从中可以看出，D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯对桃蚜均具有极显著驱避作用(t0.05=2.26，t0.01=3.25)。将二者的剂量分别减半并组成二元混合物，发现其仍对桃蚜表现为极显著的驱避作用。从驱避百分率的比较上看，D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯混合物的驱避百分率期望值为72.20%，实测值只有44.30%(χ2=0.11 ＜=3.84)，故表现为加成作用，与上述粗提物混合测试的结果基本一致。

3 讨论

当前的昆虫化学生态研究一般集中在昆虫与自然生长的寄主植物或非寄主植物的化学信息通讯方面。然而，从创制害虫行为调控剂方面来看，应当进一步扩大活性物质的筛选范围，尤其是人类经过几千年已经筛选出的用于调料和医药等用途的芳香植物，这些植物一般含有丰富的精油，嗅感浓重。我们通过前期研究发现，在30种芳香植物材料对桃蚜驱避活性的系统筛选中，广陈皮、山奈和白芷的驱避效果尤其显著［4］，但对其中的活性成分没有定性。本文选取广陈皮和山奈作为供试材料，通过索氏提取、浓缩和一系列柱层析分离步骤，结合GC-MS分析，证实了广陈皮和山奈的索氏提取物对桃蚜具有较强的驱避作用，但二者不同体积比混合物的活性没有统计学意义上的显著性差异，且等体积比混合的样品驱避活性最差，说明两种提取物存在加成效应或者微弱的拮抗作用。进一步采用乙醚和石油醚梯度混合的淋洗剂对二者进行柱层析分离，发现广陈皮中仅石油醚∶乙醚 =3∶7的洗脱液(表1中的Fr.8)具有极显著驱避作用;山奈中活性最强的馏分是石油醚和乙醚等量混合的溶剂的洗脱物(表2中的Fr.6)，另外还有其他一些驱避活性较弱的馏分。GC-MS分析表明，广陈皮活性洗脱液中含量最大的是D-柠檬烯，山奈活性馏分中含量最大的是对甲氧基肉桂酸乙酯的两种异构体。采用纯化合物进行测定证实了二者对桃蚜具有极显著的驱避活性，且二者混合表现为加成效应。

本试验发现的驱避物质D-柠檬烯大量存在于芸香科的柑橘类植物果皮中，多食性害虫桃蚜也可以利用柑橘类作为寄主植物，但主要是集中在嫩叶上危害［1］，造成桃蚜选择寄主不同部位的原因可能与嫩叶中D-柠檬烯的含量低于果皮有关，有待进一步研究予以证实。与此类似，本试验发现姜科植物山奈挥发物的主要成分对甲氧基肉桂酸乙酯大量存在于块根而不是地上部分，说明驱避害虫的天然产物资源可以来自非寄主植物，也可以来自同一寄主植物上不同的部位。后者更应当受到重视，因为这种驱避性是在来自寄主的大量引诱性物质的背景下显现出来的，与农作物田应用驱避剂的情况很相似。在寄主植物本身中发现桃蚜驱避性物质并非首例，例如，野生马铃薯Solanum berthaultii和栽培种马铃薯S.tuberosum具有A型和B型两种腺毛，这些腺毛中倍半萜类的含量存在较大差异，尽管野外观察到桃蚜可以在两种马铃薯上危害，但对马铃薯植株叶片上不同部位具有选择性［12］。此外，广陈皮粗提物和山奈粗提物对桃蚜的驱避百分率分别达59.42%和65.71%左右，而特征性气味物质D-柠檬烯和反-对甲氧基肉桂酸乙酯对桃蚜的的驱避百分率分别达到50.77%和43.53%，这说明尽管广陈皮与山奈粗提物之间以及二者的主成分之间均表现为加成效应，但山奈的主成分驱避活性与粗提物相比下降了22.18%，某些次要成分例如山奈成分中保留时间为7.17 min的第10号峰(肉桂酸乙酯)可能具有增效作用，该物质相对含量较大且与主成分结构相似。

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