Botryosphaeria rhodina A13对离体白木香形成沉香组分的作用研究

陶美华，王 磊，高晓霞，章卫民*

1广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室广东省华南应用微生物重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地广东省微生物研究所，广州 510070;2广东药学院，广州 510006

白木香［Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg］又称土 沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产沉香的唯一植物资源。当白木香树干受到损伤或刺激时会分泌一种黑色树脂，即为沉香树脂。沉香是一种名贵中药，其药用始载于《名医别录》，列为上品。其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症［1］。此外，它还是一种在亚洲广受欢迎和广泛应用的传统名贵天然香料。沉香的化学成分主要包括倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类，按结构类型来分，倍半萜类有沉香呋喃类、杜松烷类、桉烷类、大根香叶烷类等［2］。目前，白木香形成沉香的机理和过程并不清楚。

不少研究显示，沉香属植物结香与真菌相关。自20世纪30年代，从沉香属植物结香部位分离到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina)、色二孢菌(Diplodia sp.)、镰刀菌(Fusarium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂褶菌(Schizophyllum sp.)等［3］。在本课题组的前期研究中，从白木香不同部位分离到20多株真菌［4］。人工造香实验发现葡萄座腔菌菌株B.rhodina A13侵染的促香效果显著。与空白对照相比，它能使白木香快速产生黄褐色沉香树脂［5］。在此基础上，我们又对不同来源的白木香结香部位真菌类群进行研究，发现葡萄座腔菌是结香部位的优势真菌。我们的研究结果和冯乃宪的基本一致，他从沉香木块中分离到9株真菌，通过菌种对沉香组成成分苄基丙酮的耐受性实验、菌种接种后人工结香木材宽度、燃烧香味比较，发现葡萄座腔菌有促进结香作用。他还对其促进结香后精油成分进行了GC-MS分析，发现含有沉香倍半萜类沉香螺旋醇以及萘酮类、酚类等沉香形成前体成分［6］。此外，魏建和的研究结果也证实葡萄座腔菌是一种产沉香的诱导剂［7］。

为了研究真菌对白木香形成沉香的作用机理，研究人员采用了野外植株接种实验［5-7］和悬浮细胞培养方法［8］。野外植株接种实验能反映白木香结香的真实情况，但实验周期长，且容易受环境中土壤、害虫、气候等诸多因素影响。悬浮细胞培养方法条件可控，方法简单，但存在的主要问题是与植株实验有差异，如研究表明在植株水平上可以在病原菌侵染部分形成局部高浓度活性氧而起一定作用，但在悬浮细胞系统中就不能形成这种局部效应［9］。为此，本研究参照植物病理学文献［10］，首次建立了一种离体白木香枝条实验模型，为研究真菌诱导白木香形成沉香的作用机理奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

内生真菌Botryosphaeria rhodina A13分离自白木香结香部位，保藏在广东省微生物菌种保藏中心;新鲜白木香树枝采自中国林业科学研究院热带林业研究所实验基地;沉香醇浸膏由广东省信宜市珍稀沉香发展有限公司提供。

1.2 仪器

RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(II)型循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂;DLSB-5/10低温冷却液循环泵，郑州长城科工贸有限公司;FA2004电子分析天平，上海天平仪器厂;超净工作台，上海恒益科技有限公司;LRH-250-G光照培养箱，广东省医疗器械厂;Thermo Trace DSQ型色谱-质谱联用仪，美国Thermo Finnigan公司。

2 实验方法

2.1 离体白木香枝条接种试验

2.1.1 菌种活化

保藏于低温冰箱中的菌株B.rhodina A13挑取少量菌丝体接种到经高压灭菌的PDA斜面上，28℃培养7 d进行菌种活化。

2.1.2 白木香枝条的表面消毒

将粗约0.5～1 cm的新鲜白木香枝条切成约8 cm左右的小段，先在0.1%升汞溶液中浸泡3～7 min，取出后用无菌水漂洗3～4次，再放入75%乙醇中浸泡3～7 min，无菌水漂洗3～4次，然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。

2.1.3 接种

将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的培养皿上。用5 mL无菌水冲洗真菌B.rhodina A13斜面菌种，用大头吸管吸取菌液，注入到打孔的白木香枝条上。接种后培养皿用保鲜膜封口，在黑暗、27℃环境中放置20 d。同时设置未接菌的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养7 d的菌株A13菌丝对照组，每个实验组设置3个平行。

2.2 样品前处理及GC-MS分析

2.2.1 样品前处理

将各实验组样品放入三角瓶中，加入95%乙醇浸泡过夜，提取液旋转蒸发仪蒸发至干，用1.5 mL氯仿溶解后过0.22 μm微孔滤膜，待用。设置沉香对照组，将沉香醇浸膏用氯仿溶解并过微孔滤膜后备用。

2.2.2 GC-MS 分析

气相色谱条件:Agilent毛细管色谱柱DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);色谱柱程序升温条件:初始柱温60℃(保持2 min)，以5℃/min升至150℃，再以1℃/min升至160℃(保持15 min)，再以8℃/min升至250℃(保持20 min);传输线温度250℃，载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min;进样量1 μL，程序升温汽化不分流进样，初始温度60℃，14.5℃/min升温至250℃。

质谱条件:电子轰击(EI)离子源，离子源温度230℃;扫描质量范围(m/z)40～500。

各实验组组分采用NIST2002质谱数据库检索进行定性，采用色谱峰面积归一法进行相对定量。

3 实验结果

3.1 菌株A13在离体白木香树枝上的培养特征

在接种后2～4 d，离体白木香树枝打孔处长出白色菌丝体。随着培养时间的延长，在9～12天，菌丝布满整条树枝以及平皿上的滤纸，颜色由白色变成黑色(图1)。

3.2 GC-MS 分析结果

图1 菌株A13在离体白木香树枝上的培养特征Fig.1 Cultural characteristic of strain A13 in Aquilaria sinensis excised twig

(菌株A13+树枝)实验组的提取物采用GCMS鉴定出11个化合物，其化学成分主要是吡喃酮、脂肪酸、烷醇和萜类，其中萜类化合物包括2，6-二甲基，1，7-辛二烯-3-醇、异叶绿醇、叶绿醇、3，7，11-三甲基，1-月桂醇和5，9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。沉香对照组提取物中鉴定出24个化合物，其化学成分主要是萜类、脂肪酸和烷醇类，其中萜类化合物包括反-松香芹醇、双环大根香叶烯、香橙烯、绿花白千层醇、5，9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。树枝对照组提取物中鉴定出8个化合物，主要是脂肪酸和烷醇类。菌株A13对照组提取物鉴定出9个化合物，主要是炔类、脂肪酸和烷醇类(表1，图2)

表1 各实验组GC-MS分析结果Table 1 GC-MS identification results of chemical constituents of experimental groups

树枝对照组Excised twigs control group 4 21.70 (Z，Z)-9，12-Octadecadien-l-ol，亚麻醇 0.64 5 25.11 Bicyclo［3.3.1］nonan-2-ol，endo，双环［3.3.1］2-壬醇 0.76 6 28.02 Carbamic acid，氨基甲酸 0.79 7 28.36 Cyclopentanemethanol，2，2-dimethyl，2-环戊烷-2-丙醇 1.23 8 28.58 Methylenecyclooctane，亚甲基环辛烷 0.53 9 28.97 2-Methyl-oct-2-enedial 0.33 10 29.30 7-Octen-2-ol，2-methyl-6-methylene，月桂烯醇 1.45 11 30.42 2(1H)-Naphthalenone，Octahydro-1-methyl，2(1H)-萘酮，八氢-1-甲基 2.01 12 39.77 5-hydroxy-4-hydroxymethyl-1-［1-hydroxyl-1-isopropyl］ cyclohex-3-ene，5-羟基-4-羟甲基-1-［1-羟基-1-异丙基］环己-3-烯 5.58 13 48.85 9，12，15-Octadecatrienoic acid，methylester，亚麻酸甲酯 1.42 14 49.67 3-tetradecanynoic acid 1.68 15 50.78 Cyclohexaneacetic acid，2-ethyl，2-环己烷丁酸 4.45 16 51.72 3-Tetradecanynoic acid，3-十四碳烯酸 4.88 17 52.49 Aromadendrene，香橙烯 5.40 18 54.34 13-Octadecenal，13-十八碳醛 9.53 19 54.48 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 15.56 20 54.92 4-Decenoic acid，ethylester，(Z)-4-癸烯酸乙酯 1.00 21 57.23 Sulfoxide，methyl phenethyl 3.91 22 62.54 Benzeneacetic acid，phenylmethylester，苯乙酸苯甲酯 4.00 23 63.35 Viridiflorol，绿花白千层醇 0.33 24 68.915，9-Dimethyl-2-(1-methylethyldene)-1-cyclodecanol，5，9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇 0.27菌株A13对照组Strain A13 control group 1 16.08 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 2.94 2 42.40 Disulfide，1，1-dimethylethylethyl，二硫化合物，1，1-二甲基乙基，乙基 3.16 3 49.21 Benzenebutanoic acid，3-nitro-oxo，3-硝基-3-苯甲酰基丙酸 1.93 4 50.21 Nonanoid acid，壬酸 8.88 5 50.83 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 10.82 6 54.25 Hexadecenoic acid 0.08 7 54.53 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 37.75 8 59.74 1-Decanol，2-hexyl，2-己基-1-癸醇 3.49 1 16.23 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 16.02 2 23.31 1-Hepten-4-ol，1-庚烯-4-醇 3.47 3 50.50 Undecanoic acid，十一烷酸 9.03 4 50.78 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 3.65 5 53.06 1-Pentadecyne，1-十五炔 2.50 6 54.39 ［Z］，6，［Z］9-Pentadecadien-1-ol，［Z］，6，［Z］9-十五烷二烯-1-醇 8.04 7 54.49 Oleyl Alcohol，油醇 9.04 8 54.67 9-Octadecyne，9-十八炔 29.31 9 54.96 Ethyl 9-decenoate，9-癸酸乙酯3.90

图2 实验组提取物的GC-MS总离子流色谱图Fig.2 GC-MS total ion chromatograms of extracts from experimental groups

4 讨论

研究结果显示，未接菌的离体白木香树枝对照组和PDA培养7 d的菌株B.rhodina A13对照组提取物中未检出萜类化合物，而接种A13菌株的离体白木香树枝实验组和沉香对照组中都有萜类化合物，包括大根香叶烷类倍半萜5，9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇。这说明菌株A13能诱导离体白木香枝条形成沉香倍半萜类化合物。此离体实验能模拟野外植株接种实验，在野外植株接种实验中已证实有促进结香作用的真菌A13在离体条件下同样也能诱导沉香组分的产生。与野外植株实验和悬浮细胞培养实验相比，离体实验具有条件可控，方法简单，并且又接近白木香植物自然结香状况等优点，该实验方法可作为研究真菌诱导白木香形成沉香作用机理的实验模型。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，172.

2 Naef R.The volatile and semi-volatile constituents of agarwood，the infected heartwood of Aquilaria species:A review.Flavour Frag J，2011，26:73-89.

3 Zhang Z(张争)，Yang Y(杨云)，Wei JH(魏建和)，et al.Advances in studies on mechanism of agarwood formation in Aquilaria sinensis and its hypothesis of agarwood formation induced by defense response.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2010，41:156-159.

4 Wang L(王磊)，Zhang WM(章卫民)，Pan QL(潘清灵)，et al.Isolation and molecular identification of endophytic fungi from Aquilaria sinensis.J Fun Res(菌物研究)，2009，7:37-42.

5 Wang L(王磊)，Zhang WM(章卫民)，Gao XX(高晓霞)，et al.An artificial method inducing Aquilaria sinensis to generate agarwood(一种人工诱导白木香产生沉香的方法).CN102302041A，2012-01-04.

6 Feng NX(冯乃宪).Preliminary study on endophytic fungi of Aquilaria sinensis.Nanchang:Nanchang University(南昌大学)，M Sc.2008.

7 Wei JH(魏建和)，Zhang Z(张争)，Yang Y(杨云).An incense induction agent and its preparation method(一种沉香诱导剂及其制备方法).CN101731282A，2010-06-16.

8 Okudera Y，Ito M.Production of agarwood fragrant constituents in Aquilaria calli and cell suspension cultures.Plant Biotechnol，2009，26:307-315.

9 Kolewe ME，Gaurav V，Roberts SC.Pharmaceutically active natural product synthesis and supply via plant cell culture technology.Mol Pharmacol，2008，5:243-256.

10 Savocchia S，Steel CC，Stodart BJ，et al.Pathogenicity of Botryosphaeria species isolated from declining grapevines in subtropical regions of eastern Australia.Vitis，2007，46:27-32.