核桃分心木化学成分与生物活性研究

杨明珠，田新雁，肖朝江，韩冰洋，姜 北

大理学院药学院，大理 671000

分心木(Diaphragma juglandis Fructus)为胡桃科植物胡桃(Juglans regia L.)果核内的木质隔膜，又名胡桃衣、胡桃夹、胡桃隔、核桃隔膜。中医认为，本品性味苦、涩、平，入脾、肾经，有健脾固肾、利尿清热，治淋病尿血、暑热泻痢等功效，适用于治疗遗溺、崩中下血、耳聋、治遗精、尿频、带下等。用核桃分心木泡水喝，具有补肾涩精的功能，对多汗、尿频、遗尿、肾虚遗精、口腔溃疡、牙龈出血、小便多等也有功效，且具有一定的抗菌活性［1］。

胡桃为云南省的重要支柱型经济林木之一，其中大理地区为优质核桃品种漾濞泡核桃(Juglans sigillata Dode)的主产区，2009年产量达到12.33万吨［2］，副产品分心木6千吨以上，全省分心木资源蕴藏量更是十分巨大。虽然近年来国内关于胡桃研究已相当广泛，研究范围包括核桃仁、核桃壳、核桃青皮、枝叶、树皮、根皮等，发现了许多抗肿瘤、抗氧化活性成分，但对分心木的化学成分与药理活性研究报道却十分有限，致使分心木(与核桃壳一道)除用于烧制活性炭或作燃料外，基本上无任何其它方面的应用，极大限制了该资源的价值与用途。因此，如能对云南丰富的分心木资源进行研究利用，变废为宝，无疑可为当地的社会经济发展做出重大贡献。

据文献报道，付文焕等曾从鞣质定性分析入手研究建立分心木药材质量标准的方法［3-4］;王艳梅、毕肯·阿不得克里木等采用传统化学反应方法对分心木的化学成分进行了定性分析，初步推断其中含有氨基酸、蛋白质、糖类、酚类、有机酸、黄酮、生物碱、强心苷、挥发油、甾类、皂苷、蒽醌类、内酯、香豆素、油脂等多种成分［5，6］;然而，有关分心木中单体化学成分分离、结构鉴定至今未见报道。本项目对分心木75%乙醇提取物进行了系统的化学成分研究，由乙酸乙酯部位分离鉴定了11个化合物，本文报道这些化合物的结构鉴定及分心木提取物的抗氧化、抗菌活性研究结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

质谱由VG Auto Spec-3000质谱仪测定，电离条件为70 eV;1H与13C NMR由Bruker AM-400核磁共振波谱仪测定，四甲基硅烷(TMS)为内标。柱层析硅胶材料、薄层层析板硅胶G和GF254均为青岛海洋化工厂生产;葡聚糖凝胶为Sephadex LH-20(Amersham Biosciences，Sweden);氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇均为工业纯试剂，正丁醇、氯化钠(天津市风船化学试剂科技有限公司)均为分析纯试剂;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Aldrich Chem Co，USA)，营养琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)，液体沙氏培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)，琼脂粉(天津市大茂化学试剂厂)，0.5麦氏比浊标准管，滤纸、接种环、微量加样器等。核桃分心木(Diaphragma juglandis Fructus)采于云南省大理州漾濞县，由大理学院药学院生药学教研室周浓副教授鉴定。标本(DLYX-JIANG-2009-10-01)存放于大理学院药学院姜北教授研究组。菌种:所有菌种均由大理学院基础医学院微生物与免疫实验室提供，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌、H901伤寒杆菌、白色念珠菌。

1.2 提取与分离

核桃分心木10.0 kg，粉碎后用75%乙醇冷浸提取，浓缩后得到浸膏1.1 kg，用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得相应提取物。取200 g乙酸乙酯萃取浸膏，进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脱，得Fr1～Fr7七个部分。Fr2经硅胶柱层析石油醚-乙酸乙酯洗脱后得化合物1、2和4，相应部位再经Sephadex LH-20纯化后得3，经RP-18反相层析得6。Fr3经硅胶柱层析，氯仿-丙酮、石油醚-丙酮洗脱后，再经Sephadex LH-20纯化得10;相应部位经RP-18反相层析得5;用石油醚-丙酮系统硅胶柱层析粗分，再经Sephadex LH-20、石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析、重结晶后得9;经氯仿-甲醇系统硅胶柱层析得8和11。Fr4经硅胶柱层析氯仿-丙酮、石油醚-丙酮洗脱，再用Sephadex LH-20纯化，经重结晶得7。

1.3 抗氧化活性测试

核桃分心木75%乙醇粗提物(A)，经D100大孔树脂柱梯度洗脱，得水部分浸膏(B)、50%乙醇部分浸膏(C)、95%乙醇部分浸膏(D);50%乙醇部分浸膏再用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯提取物(E)、正丁醇提取物(F)和萃取剩下的水相 (G)。精确称量样品提取物10 mg左右，溶解在2 mL DMSO中，之后用 DMSO按1∶3、1∶1、1∶1、1∶1 的比例稀释。以 DMSO、维生素 C 分别作为对照，在96孔板上用50 μL供试品与150 μL DPPH(400 mmol·L-1)液混合，放入37℃的恒温培养箱中30分钟，之后用酶标仪于515 nm处测定OD值，最后计算出供试品的IC50数值。

1.4 抗菌活性供试样品

准确称取供试样品2.0 g溶于20 mL灭菌蒸馏水中，超声溶解，吸取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。剩下的不溶物冷冻干燥，扣除其重量，从而计算药物原液的浓度。

1.5 纸片扩散法抗菌活性测试［7］

将厚度为1.5 mm的优质定性滤纸用打孔机制成直径为6 mm的小圆片，置于培养皿中灭菌，烘干。然后放到药物原液中浸泡2 h，待用。用接种环挑取待测菌体置于少量生理盐水中，配制成0.5麦氏标准的菌悬液，待用。取100 μL菌悬液置于营养琼脂板上，用灭菌棉签均匀涂开，将含药滤纸片分别贴于平板表面，37℃培养18 h，根据药敏纸片周围显出的抑菌圈大小来判断抗菌作用的强弱，通过此法初步筛选敏感细菌谱。对照组为生理盐水。

1.6 肉汤稀释法抗菌活性测试［7］

将药物原液用蒸馏水按1∶1稀释成系列药液。取M-H肉汤商品培养基制成M-H肉汤，灭菌后备用。然后向各稀释药液中加入M-H肉汤，混合均匀，即成含药肉汤。用接种环取适量测试菌，用3～5 mL的生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用M-H肉汤1∶10稀释，使含菌量达到107CFU·mL-1。用微量加样器取0.1 mL稀释菌液由低药物浓度向高药物浓度加于各稀释药液中，每种提取物和其相关的每一种敏感菌均同时进行3组实验;37℃恒温箱培养24 h(白色念珠菌培养48 h)后，将各药物的菌液分别接种到 M-H培养基上，经37℃恒温箱继续培养24 h后，根据划线处细菌生长情况判断该种药物的最小抑菌浓度。对照组采用测试菌生长对照方式进行。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物1 黄色结晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz) δ:12.20(1H，s，-OH)，12.07(1H，s，-OH)，7.56(1H，s，H-4)，7.25(1H，d，J=2.3 Hz，H-5)，7.14(1H，s，H-2)，6.66(1H，d，J=2.3 Hz，H-7)，2.47(3H，s，-CH3);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:166.2(C-1)，108.8(C-2)，149.5(C-3)，109.6(C-4)，134.2(C-4a)，121.4(C-5)，163.2(C-6)，124.9(C-7)，166.3(C-8)，114.0(C-8a)，191.7(C-9)，110.0(C-9a)，182.1(C-10)，136.6(C-10a)，21.9(-CH3)。其波谱数据与文献［8］基本一致，确定化合物1为大黄素。

化合物2 白色粉末，易溶于氯仿，1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ:0.75，0.77，0.90，0.91，0.92，0.98，1.13(各 3H，s，CH3× 7);13C NMR(CD3Cl，125 MHz)δ:38.4(C-1)，27.0(C-2)，79.0(C-3)，38.7(C-4)，55.2(C-5)，18.3(C-6)，32.7(C-7)，39.3(C-8)，47.6(C-9)，37.2(C-10)，23.0(C-11)，122.4(C-12)，143.8(C-13)，41.6(C-14)，27.7(C-15)，23.4(C-16)，46.3(C-17)，41.2(C-18)，45.9(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.5(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，15.3(C-25)，16.9(C-26)，25.9(C-27)，181.1(C-28)，33.0(C-29)，23.5(C-30)。其波谱数据与文献［9］一致，化合物2鉴定为齐墩果酸。

化合物3 白色结晶，易溶于氯仿、丙酮，1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:12.45(1H，s，OH-8)，7.52(1H，dd，J=7.5，8.4 Hz，H-6)，7.11(1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，6.82(1H，d，J=8.4 Hz，H-7)，4.65(1H，d，J=5.6 Hz，H-4)，2.88(1H，m，H-2b)，2.69(1H，m，H-2a)，2.37(1H，m，H-3b)，2.15(1H，m，H-3a);13C NMR(CD3COCD3，125 MHz)δ:204.1(C-1)，35.9(C-2)，32.5(C-3)，67.7(C-4)，149.1(C-4a)，118.3(C-5)，137.5(C-6)，117.1(C-7)，163.3(C-8)，115.9(C-8a)。其波谱数据与文献［10］基本一致，化合物3鉴定为Isosclerone。

化合物4 白色粉末，溶于氯仿，在TLC上三种不同溶剂系统展开时化合物4与正十七烷标准品Rf值一致，故化合物鉴定为正十七烷。

化合物5 白色结晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，500 MHz)δ:7.91(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.91(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，3.90(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，H-9)，3.12(2H，t，J=6.0，H-8);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:135.6(C-1)，136.5(C-2，6)，121.1(C-3，5)，167.9(C-4)，203.2(C-7)，46.7(C-8)，63.8(C-9)。其波谱数据与文献［11］相似，化合物5鉴定为3-羟基-1-(4-羟基取代苯基)-1-丙酮。

化合物6 白色片状结晶，易溶于氯仿，1H NMR(C5D5N，500 MHz)δ:4.20(2H，dd，J=4.5，11.6 Hz，H-1)，4.15(1H，d，J=9.0 Hz，OH-2)，3.93(1H，m，H-2)，3.70(1H，dd，J=3.9，11.4 Hz，H-3a)，3.60(1H，dd，J=5.8，11.4 Hz，H-3b)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H-2’)，1.62(2H，t，J=7.0 Hz，H-3’)，1.25(28H，m，H-4’～ 17’)，0.88(3H，t，J=6.7 Hz，H-18’)。其波谱数据与文献［12］基本一致，化合物6鉴定为硬脂酸甘油单酯。

化合物7 白色结晶，易溶于丙酮，ESI-MS m/z:169 ［M-H］－;1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.13(2H，s，H-2，6)。其波谱数据与文献［13］基本吻合，在TLC上与没食子酸标准品Rf值一致，化合物7鉴定为没食子酸。

化合物8 白色结晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.11(2H，s，H-2，6)，4.24(2H，q，J=7.1 Hz，-OCH2-)，1.30(3H，t，J=7.1 Hz，-CH3);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:122.1(C-1)，109.7(C-2，6)，146.0(C-3，5)，138.5(C-4)，166.6(C=O)，60.8(-OCH2-)，14.6(-CH3)。其波谱数据与文献［13，14］基本一致，化合物8鉴定为没食子酸乙酯。

化合物9 白色结晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.94(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5)，6.95(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)，5.07(1H，br s，H-8)，3.86(1H，dd，J=3.4，11.2 Hz，H-9a)，3.77(1H，dd，J=4.2，11.2 Hz，H-9b);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:127.4(C-1)，116.1(C-2，6)，132.0(C-3，5)，163.1(C-4)，198.8(C-7)，75.0(C-8)，66.2(C-9)。其波谱数据与文献［11］基本一致，化合物9鉴定为核桃素 D。

化合物10 白色结晶，易溶于丙酮，1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.91(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.91(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:122.5(C-1)，115.8(C-2，6)，132.7(C-3，5)，162.4(C-4)，167.6(C-7)。其波谱数据与文献［15］基本一致，化合物10鉴定为对羟基苯甲酸。

化合物11 淡黄色针晶，易溶于甲醇，1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.58(1H，dd，J=1.5，8.0 Hz，H-6)，7.55(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)，6.90(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.89(1H，s，-OCH3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.8(C-1)，115.4(C-2)，147.9(C-3)，152.6(C-4)，113.3(C-5)，124.7(C-6)，167.3(C-7)，56.3(-OCH3)。其波谱数据与文献［16］基本一致，确定化合物11为香草酸。

2.2 抗氧化活性测试

由分心木提取物衍生出的样品A-G的抗氧化活性测试结果见表1。

表1 供试样品的抗氧化IC50值Table 1 The antioxidant IC50values of the fractions extracted from Diaphragma juglandis

2.3 抗菌活性测试

3 讨论

实验中由分心木提取物中分离鉴定了11个化合物，这是首次由分心木中分离报道单体成分，主要为多酚类、有机酸、醌类及萜类等。从我们的研究结果可以看出，分心木提取物中小分子部分普遍具有较强的抗氧化活性，同时，其乙酸乙酯部位的抑菌作用明显强于其它各个提取物部位，说明乙酸乙酯部位是抗菌的有效部位;由该部位分离得到的单体成分没食子酸乙酯(8)也显示出很好的抗菌活性与较大抗菌谱，间接证实分心木被用于治疗淋病、血尿、带下、泻痢、肾炎等病症具有一定的科学依据。本研究对于深入了解分心木的活性成分与药用价值具有重要意义。

表2 纸片扩散法试验结果Table 2 Testing results for antibacterial activities(disk diffusion method)

表3 常量肉汤稀释法Table 3 Testing results for antibacterial activities(broth dilution method)

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