聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶的研究进展

杨清媛 张相年 赵树进 (广州军区广州总医院药学部，广东 广州 5000)

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的自由基清除剂，主要催化超氧阴离子(O·-2)的歧化反应，能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。在临床上SOD主要用于延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护。但半衰期短、稳定性差、免疫原性等因素限制了SOD的临床应用。为解决这些问题，国内外用化学修饰、基因重组和SOD修饰物等改造方法来延长半衰期、增强酶的稳定性、降低酶的免疫原性，目前对SOD进行化学修饰是研究的热点，且取得了很大的进展。国内外有用脂肪酸、多糖类物质、月桂酰氯、右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)等〔1，2〕作为修饰剂的报道，而以 PEG及其衍生物对SOD的修饰较为有效。本文着重对PEG的修饰原理、修饰物种类及修饰后产物的分析方法进行综述。

1 PEG修饰原理

PEG由环氧乙烷聚合而成，最简单的结构是一种直链的以羟基结尾的聚醚，其分子式为 HO-(CH2CH2O)-CH2CH2-OH。直接用PEG修饰时易发生交联和团聚现象，故单甲氧基PEG(mPEG)应用较多，其分子式为CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，即将PEG一端的活性羟基用甲氧基封闭，以减少或避免交联或团聚现象，是一种水溶性聚合物。PEG与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成一个PEG保护层，使得底物与酶的接触受到一定的空间阻隔，可作为一种屏障挡住蛋白分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原和抗体的结合而抑制免疫反应的产生，酶活性因而下降。同时，正是由于这种保护层的形成保护了该酶免受体内水解酶的消化，表现了较强的抗酶水解能力。蛋白经PEG修饰后分子量增加，分子的体积增大，肾小球过滤减少，PEG的屏障作用保护了蛋白不易被蛋白酶降解，同时减少了抗体的产生，PEG的修饰使蛋白大分子可以避免被肾脏很快地排除，因而其血浆存留时间得到显著延长，这些均有助于蛋白药物循环半衰期的延长。同时，PEG修饰会使蛋白活性降低，这种影响大小与修饰剂、修饰条件和蛋白本身的特点相关〔3～5〕。

1.2 修饰剂种类和修饰途径〔6，7〕对于修饰反应的特异性，mPEG修饰剂的发展经历了第一代和第二代。第一代小Mr(＜20 000)PEG修饰为非定点修饰，mPEG交联的基团是赖氨酸的α-氨基和ε-氨基，交联度不均一，没有特异性，PEG修饰后的蛋白产物是混合物，使修饰蛋白的分离纯化和鉴定很困难，不利于工业化生产。第二代高Mr(＞20 000)PEG修饰则向定点修饰(特异性修饰)方向发展。第二代mPEG修饰中，分为赖氨酸ε-氨基定点修饰、N末端定点修饰等。

表1 修饰SOD常用的mPEG修饰剂

以下简单介绍几种修饰的合成路线:

(1)氰脲酰氯法 -CC mPEG是由mPEG和CC在绝对无水条件下制备而成，易与蛋白上氨基发生反应，为最经典的耦联方法。该方法得到的修饰SOD氨基修饰率达到80%，酶活力保持75%，且可以降低酶的免疫原性，同时增加了对蛋白水解酶的抵抗能力，提高在体内的半衰期。缺点是易水解，修饰选择性不高，修饰产物不均一，且这种合成方法引入有毒的三氯均三嗪，从而其修饰产物只能用于工业化生产，限制了在其他领域的应用。

(2)1，1'-羟基二咪唑法〔8〕该种方法是通过mPEG上的-OH基团与1，1'-羟基二咪唑法发生酯化反应，再与SOD反应制得。此法设备简单，反应条件温和，耦联物稳定，可以使酶活力保持95%以上，但耦联反应慢，反应时间太长，修饰产物易酶解，另外原料也不易获得，所以应用时有一定的困难。

(3)N-羟基琥珀酰亚胺法 SS-mPEG已被广泛使用多年，其修饰SOD上赖氨酸残基的氨基。该法可以使酶活力保持90%以上，且修饰产物比较均一，但反应步骤太长，操作繁琐，应用颇为不便。

(4)mPEG 还原烷基化反应〔9，10〕mPEG-醛是一种新型PEG修饰剂，与蛋白上赖氨酸残基的α-氨基或N末端-氨基通过曼尼希反应形成Schiff碱，经过氰基硼氢化钠(NaCNBH3)还原形成比较稳定的亚胺连接体，该法连接键相对稳定，反应选择性高，常见的多态性大为减低。

2 检测方法

目前，对修饰后SOD进行分析的方法主要有分光光度法、色谱、电泳、红外光谱、核磁共振、质谱等〔11〕。

2.1 肽图谱〔12〕肽图谱是蛋白质经水解后测定肽段以获得相关的信息，是生物制品高特异的鉴定方法。目前主要有液相肽图和质谱肽图。

2.1.1 液相肽图 双向电泳、等电聚焦电泳等凝胶电泳技术在蛋白质多肽的纯度、杂质检查以及分子量、等电点、含量测定等方面发挥了重要作用。对于分子量大于10 kU的蛋白质，凝胶电泳技术已日臻完善;而对于分子量小于10 kU的小分子多肽分析总是不尽如人意。

Nadithe等〔13〕使用分子尺寸排阻色谱(Size Exclusive Chromatography，SEC)分离了 PEG修饰的血红蛋白-抗氧化酶组(Hb-SOD-CAT)，测定了PEG-Hb-SOD-CAT各分离峰的280 nm紫外吸收值和平均分子量。

高效毛细管电泳(HPCE)是近十几年发展起来的一项新的分析技术，它将电泳技术和色谱技术结合，以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依样品中被测组分之间电泳淌度和分配系数的不同而达到分离目的。具有分离效率高，速度快、模式多等特点。Bullock等〔14〕使用毛细管电泳法检测了PEG5000-SOD的修饰度分布，分离了耦联有1～8个PEG链的不同的SOD蛋白，并对其进行了定量分析，其结果与MALDI质谱分析结果基本一致。

2.1.2 质谱肽图〔15〕质谱(MS)具高灵敏性和快速性，特别适合分析多肽类物质。目前应用较多的有连续流快原子轰击质谱法，电喷雾离子化质谱法和基质辅助激光解吸质谱法。基质辅助激光解吸质谱法(MALDI-MS)特别适合混合蛋白质多肽类物质相对分子量的精确测定，其最大优点是允许样品中含有几百毫摩尔的缓冲液及表面活性剂，且灵敏度比别的离子化方式高。Chowdhury等〔16〕采用MALDI-MS法分析了PEG修饰的SOD，发现SOD是一种非共价结合的二聚体，每个SOD单体包含了10个赖氨酸，是连接PEG的位点，有0～7个不等数目的PEG分子耦联到了牛血清SOD上。

2.2 核磁共振(NMR) 该法广泛用于解析化学物质结构和反应性能，已发展为分子生物学的重要实验技术。NMR主要用于核定多肽的微观理化性质，可以检测一些不能用X-射线晶体衍射分析方法检测的多肽。

Banci等〔17〕研究了钴盐取代的PEG-SOD的1H-NMR氢谱，结果可知进行PEG表面化学修饰后的酶活降低并不是因为扰乱了活性位点的几何结构，而是由往酶活性位点运输O-2离子的通道减少所导致。

3 生物活性测定

SOD被PEG修饰后在临床应用中显示出优良性质。研究表明经过化学修饰后的SOD基本上保持了天然酶的活性，在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高〔18〕。SOD的活性测定方法多为间接法。

3.1 物理法 基本原理为根据O－2的物理性质测定O－2的歧化量，从而确定SOD的活力。已知的方法有脉冲辐射分解法、NMR和电子顺磁波谱法。所需的仪器昂贵，较少应用。

3.2 一般化学法

3.2.1 细胞色素C还原法 国外多采用，但该法灵敏度较低，易受反应底物不纯的影响。

3.2.2 邻苯三酚法〔19，20〕邻苯三酚在pH8.3的缓冲液中发生自氧化反应，产生O－2。其自氧化率受到SOD的抑制。这种方法具有操作简便，试剂简单等优点。但是该法的显色反应与光吸收值(A420)测定必须同步进行，且不能同时处理多个样品。现多采用改进后的邻苯三酚自氧化法。

3.3 电泳法 将待测样品与标准品SOD进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可直接进行SOD蛋白谱带染色，SOD酶活性正染色，或是SOD酶活性负染色。由于SOD正染和负染的灵敏度较高，0.1个酶活性单位的SOD在凝胶上即可显示出可目测的SOD活性谱带，因此可配成一系列SOD浓度梯度的标准样品，同待测样品一起电泳，通过对SOD谱带进行线形扫描，便可准确测出样品中的SOD活性。该法不及化学法简便，但鉴定SOD时，却较化学法为优。

此外，还有氯化硝基四唑氮蓝(NBT)还原法〔21〕、没食子酸法、亚硫酸盐法、6-羟多巴胺法、NBT光还原法、光还原法、电还原法和免疫学法等等。

4 结语

对于改善SOD的临床作用时间和疗效，PEG修饰技术已被公认为最为有效的方法之一。但现今对SOD的PEG修饰多采用常规的多点修饰，不能得到理想的修饰效果。而且多点随机修饰反应后的产物是一混合物，呈现出的多态性给PEG修饰的SOD分析带来较大困难。因此随着PEG修饰蛋白技术研究的不断深入，定点单修饰得到了不断发展。这对于SOD未来的应用前景有着重要的意义。

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