基质金属蛋白酶-2与结直肠癌浸润和转移的相关性

周艳红 (唐山职业技术学院基础医学部，河北 唐山 063000)

基质金属蛋白酶(MMPs)是含有9种酶蛋白分子的家族，可以导致基质膜和细胞间质成分破坏与降解，在恶性肿瘤的侵袭与转移中发挥重要作用。近年来研究证明MMP-2在肿瘤的浸润和转移中起了关键作用〔1〕。本研究拟探讨MMP-2与结直肠癌发生、发展、浸润和转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取唐山市协和医院2005～2007年间资料齐全的结直肠癌标本存档蜡块53例，正常人黏膜组织37例;年龄41～75(平均56)岁;以上标本均经病理证实。患者术前均未进行放疗、化疗或激素治疗。结直肠癌临床分期采用TNM方案。Ⅰ期+Ⅱ期22例，Ⅲ期+Ⅳ期31例。淋巴结转移阳性33例，淋巴结转移阴性20例。

1.2 试剂 Trizol为美国 Promega公司产品。引物由大连宝生物公司合成，RT-PCR试剂盒为大连宝生物公司产品。其他试剂均为国产分析纯。兔抗人MMP-2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) ①RNA提取和逆转录:参照Trizol试剂说明书进行，取1 μg总RNA为模板，逆转录成cDNA。②PCR:应用Omiga2.0设计 MMP-2和β-actin引物，见表1。按RT-PCR试剂盒操作，循环条件:预变性94℃2 min;变性94℃ 30 s;退火55℃ 30 s;延伸72℃ 45 s;35个循环后72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果用凝胶自动成像2000系统扫描，并以β-actin校正作相对量分析，数值以两者吸光度的比值表示。

表1 PCR引物

1.4 免疫组织化学检测 采用SP法，严格按照试剂盒说明书进行操作，用已知的结直肠癌癌阳性组织切片做阳性对照，用PBS代替一抗做空白对照。

1.5 结果判定 阳性反应判定标准依据阳性细胞数和阳性反应强度两项指标:阳性着色细胞数＞15%定为阳性表达;阳性反应强度以浅黄色为弱阳性(+)、黄色或棕黄色为中等阳性()，棕色或者深棕色为强阳性())，无棕黄色或与背景着色一致为阴性(－)。

2 结果

2.1 MMP-2 mRNA在结直肠癌中的表达 结直肠癌组织中MMP-2 mRNA水平(0.821 8±0.033 75)明显高于正常结直肠黏膜组织(0.671 2±0.025 05)，平均为正常结直肠黏膜组织的1.22倍(以 MMP-2/β-actin灰度比值代表 MMP-2之 OD值)(t=7.060，P ＜0.01)，见图1。

图1 结直肠癌及正常结直肠黏膜组织中MMP-2 mRNA表达

2.2 MMP-2蛋白在结直肠癌中的表达 MMP-2阳性表达部位主要在细胞质中，呈棕黄色颗粒，细胞膜有少量表达。与正常黏膜组比较，结直肠癌组MMP-2阳性表达率呈上升趋势〔3例(8.1%)vs 40 例(75.5%)〕(χ2=16.729，P ＜0.01)。

2.3 MMP-2与结直肠癌临床病理参数之间的关系 MMP-2在高、中、低分化癌组织中的表达分别为75.0%(15/20)、70.0%(14/20)、84.6%(11/13)(χ2=0.913，P=0.633)，差异无统计学意义;MMP-2在淋巴结转移阳性组表达率93.9%(31/33)显著高于淋巴结转移阴性组〔45.0%(9/20)〕(χ2=16.111，P=0.001);直肠癌Ⅲ+Ⅳ期中 MMP-2阳性表达率〔96.8%(31/33)〕显著高于Ⅰ +Ⅱ期〔45.5%(10/22)〕(χ2=18.307，P=0.001)。

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移是一个多环节多步骤的癌细胞与宿主细胞相互作用的连续过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱离、侵犯周围局部组织、进入循环系统、停留于已形成的血管床、外渗入靶器官间质以及在远隔器官增生形成转移灶等。MMPs是一族蛋白酶，在哺乳动物中有24个成员，参与细胞外基质降解，其表达异常与肿瘤细胞侵袭转移密切相关，成为研究恶性肿瘤侵袭转移的热点〔2〕。国内研究发现MMP-2在多种肿瘤组织中(如肺癌、胃癌、食管癌、卵巢上皮癌、宫颈癌等)表达水平均显著高于相应正常黏膜组织，同时发现MMP-2水平与肿瘤分期及远处转移密切相关，提示MMPs与肿瘤进展相关，并指出了为肿瘤干预治疗而对MMPs进行研究的重要性〔3～7〕。国外学者Roeb等〔8〕在对20例结肠癌、10例直肠癌患者进行研究时发现，结肠组织中MMP-2及MMP-9在肿瘤组织中水平均显著高于相应正常黏膜组织，以MMP-9升高明显;而在直肠肿瘤中，仅MMP-2水平显著增高。本研究结果提示MMP-2与结直肠癌的发生发展有着密切关系，MMP-2高表达的患者，癌组织分化更低，更易发生淋巴结转移。其具体的作用机制可能与参与细胞外基质降解密切相关。

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