α－硫辛酸对糖尿病大鼠糖外周组织内UCP2 mRNA表达的影响及意义

张 梅 李 萍 孙海玲 李艳英 班 博 (济宁医学院附属医院内分泌科，山东 济宁 272000)

2型糖尿病以胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷为主要的病理生理基础，胰岛素抵抗是指胰岛素的靶器官 (包括骨骼肌、脂肪等)对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计正常水平的一种现象，它可导致胰岛素介导下的骨骼肌、脂肪组织对葡萄糖的摄取、利用或储存的效力减弱，机体胰岛β细胞代偿出现高胰岛素血症，并逐渐出现高血糖。正常状态下骨骼肌及脂肪组织对葡萄糖的摄取是维持体内葡萄糖代谢合成平衡重要因素。目前国内外众多的研究已证实UCP2可以通过影响ATP的生成、调节胰岛素的分泌、抑制氧自由基 (ROS)的生成、诱发胰岛β细胞的凋亡等参与糖尿病的发生发展过程，并也因此成为了治疗2型糖尿病的新的研究热点。本研究通过观察2型糖尿病糖尿病大鼠糖脂代谢、氧化应激水平及UCP2 mRNA表达水平及之间的相互影响，并观察α－硫辛酸 (LA)对其的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试验仪器与药品 微量血糖仪(One TouchⅡ型，美国强生公司)及相应型号试纸，糖化血红蛋白(HbAlc)测定仪(BIO－RAD REF 220－0101)，全自动生化分析仪(HITACHI 7600－120)，电子天平(上海良平YP6001)，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，LA(产品批号 2574)购自德国STADA公司，总RNA提取试剂Trizol及CR SuperMix购自美国Invitrogen公司，琼脂糖购自北京世纪银丰科技发展中心，丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(T－AOC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物 健康雄性Wistar大鼠30只，体重180～200 g，购自山东省新华鲁抗动物实验中心(许可证号为:SCXK鲁20080002)，饲养温度(22±1)℃，湿度40% ～60%，光－暗周期12 h。用普通饲料适应性喂养7 d后随机分为对照(NC)组8只和实验组22只，NC组继续普通饲料喂养，实验组改用高脂饲料喂养，基础饲料购自山东省新华鲁抗动物实验中心，高脂饲料是在60%的基础饲料中加入5%蛋黄粉、20%蔗糖和15%猪油混合而成。饲养期间大鼠的精神状态、摄食、饮水及活动情况均未见明显异常，无死亡。

1.3 方法 实验组大鼠高脂饲养4 w后，禁食12 h，将STZ溶于0.1 mol/L枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液(pH4.2)溶液中，配成浓度为1%的溶液，单次腹腔注射30 mg/kg，NC组给予等量的枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液腹腔注射，72 h后尾静脉测血糖，血糖＞16.7 mmol/L为造模成功，共成模18只，随机选取16只成模者纳入本实验，继续高脂饮食4 w后随机分为LA、糖尿病(DC)组，每组8 只，分别给予 LA 60 mg·kg－1·d－1、生理盐水2 ml/d 4 w，实验期间，动物自由摄食和饮水。每周测一次血糖和体重。

1.4 标本收集与检测 用药4 w后，禁食12 h，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，开胸，胸主动脉抽血检测HbA1c、血糖、血脂，取出肝脏－80℃冰箱冻存备用测 AMPKα。亲和层析微柱法测HbA1c，血糖血脂胰岛素由全自动生化分析仪及全自动电化学免疫分析仪测定;应用RT－PCR检测脂肪、骨骼肌组织UCP2 mRNA的表达水平;应用比色法测定肝脏内 MDA及 T－AOC水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组体重变化 造模1 w后即在饲养5 w后NC组与DC、LA组相比差异显著(P＜0.05)，DC组与LA组间体重无差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠空腹血糖(FBG)、HbA1c及胰岛素水平比较造模前各组大鼠FBG无明显差异(P＞0.05)，至造模后实验组较正常组相比较FBG明显升高，且胰岛素亦明显升高(P＜0.01);LA组与DC组比较FBG显著降低，胰岛素明显下降(P＜0.05);各组大鼠HbA1c水平比较，与FBG变化趋势一致。见表2。

2.3 各组大鼠血脂水平比较 与NC组相比较，DC组、LC组甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均升高，高密度脂蛋白(HDL)下降(P＜0.05)，但LC组与NC组相比游离脂肪酸(FFA)无明显差别(P＞0.05);与DC组相比较LA组TG、TC、LDL均有下降，HDL有明显升高(P＜0.05或 P＜0.01)。见表3。

表1 各组大鼠体重变化(n=8，g，)

表1 各组大鼠体重变化(n=8，g，)

与NC组比较:1)P＜0.05

组别 1 w 造模后 用药前 用药后NC 196.5±9.4 347.5±13.0 411.3±16.2 421.9±15.2 DC 193.9±7.0 344.4±14.7 354.4±15.21)360.3±15.11)LA 195.0±9.7 361.0±14.7 359.4±17.21)365.0±16.31)

表2 各组大鼠FPG、HbA1c、胰岛素水平比较(n=8，)

表2 各组大鼠FPG、HbA1c、胰岛素水平比较(n=8，)

与NC组比较:1)P＜0.01;与DC组比较:2)P＜0.05

组别 FBG(mmol/L) 胰岛素 HbA1c(%)NC 4.94±0.512) 8.51±1.272) 4.8±0.672)DC 23.32±2.871) 19.1±1.601) 13.0±1.561)LA 20.6±2.321)2) 14.08±1.791)2) 10.1±2.101)2)

表3 各组大鼠血脂水平比较(n=8，mmol/L，)

表3 各组大鼠血脂水平比较(n=8，mmol/L，)

与 NC组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与 DC组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

组别TG TC LDL HDL FFA NC 0.48±0.164) 1.33±0.234) 0.31±0.064) 1.00±0.164)0.33±0.11 DC 3.75±0.452) 3.08±0.272) 1.46±0.282) 0.82±0.192) 0.53±0.102)LA 2.20±0.402)3) 2.21±0.311)3) 0.85±0.123) 0.95±0.223) 0.40±0.113)

2.4 各组大鼠脂肪及骨骼肌组织内MDA、T－AOC的比较 与NC组比较，DC组LA组大鼠脂肪及骨骼肌组织内MDA含量均有升高，而T－AOC均有下降(P＜0.05或者P＜0.01);与DC组比较，LA组大鼠脂肪及骨骼肌组织中MDA含量均有下降，T－AOC均有升高(P＜0.05或P＜0.0)。见表4。

表4 各组大鼠不同组织内MDA水平的比较(nmol/mgprot，n=8，)

表4 各组大鼠不同组织内MDA水平的比较(nmol/mgprot，n=8，)

组别 骨骼肌 脂肪NC 2.31±0.894) 1.33±0.234)DC 6.43±1.222) 3.08±0.272)LA 5.24±1.072)3) 2.21±0.311)3)

2.5 各组间UCP2 mRNA表达水平的比较 算出每个样品及GDAH的灰度值。并用UCP2的灰度值除以GDAH灰度值得出比值(OD比值)。将以上数据统计分析。与NC组比较，DC组、LA组脂肪及骨骼肌组织内UCP2 mRNA的表达明显增加(P＜0.05或P＜0.01)，但在脂肪组织中的表达无明显差异(P＞0.05);与DC组比较LA组各组织内UCP2 mRNA的表达均明显下降(P＜0.05)。见表5及图1、图2。

图1 各组骨骼肌组织内UCP2 mRNA的表达

表5 各组大鼠不同组织内UCP2 mRNA表达水平(OD比值)的比较(n=8，)

表5 各组大鼠不同组织内UCP2 mRNA表达水平(OD比值)的比较(n=8，)

组别 脂肪 骨骼肌NC 0.92±0.064) 0.77±0.104)DC 1.10±0.052) 1.05±0.082)LA 0.97±0.074) 0.95±0.062)3)

图2 各组脂肪组织内UCP2 mRNA的表达

3 讨论

解耦联蛋白2(UCP2)是一种解耦联剂，它是线粒体内膜载体家族的一员，作为线粒体内膜上参与质子转运的蛋白质，它具有控制活性氧产生、调节能量平衡、调节ATP产生速度、抗细胞凋亡等生理功能，参与许多疾病的病理生理学过程。实验研究提示其表达或功能异常与代谢性疾病及肥胖相关。

UCP2的表达受脂肪酸、血糖及一些激素调节的影响。目前脂肪酸对非胰岛组织UCP2的诱导作用已经得到了证实〔1〕。应用油脂酸培养肝细胞12～16 h，结果显示肝细胞内 UCP2 mRNA的表达增加8倍以上。同时亦有动物实验的研究〔2〕表明用脂肪乳持续灌注大鼠24 h能显著增加其心脏和骨骼肌中UCP2的表达。本研究显示糖尿病大鼠TG、TC、LDL及FFA明显升高，同时HDL明显降低，并且其骨骼肌及脂肪组织内UCP2 mRNA的表达均明显升高，与以往研究结果一致。有研究〔3～5〕表明α－硫辛酸可通过多种机制调节糖尿病状态下的脂代谢紊乱，本研究结果证实了LA对脂代谢的调节作用及血脂对UCP2 mRNA的调节作用。血脂对UCP2 mRNA表达的调节机制尚不明确，有细胞内的实验研究〔6〕表明，其可能机制为通过未酰化的脂肪酸激活过氧化物酶体激活受体 γ(PPAR γ)作用于UCP2 mRNA的启动调控区，而被此作用元件调控而上调表达。

目前高血糖对UCP2的影响结果不尽相同。Hjeltnes等〔7〕通过给予给予大鼠葡萄糖负荷后检测肌肉中UCP2 mRNA的表达水平，发现其与血浆葡萄糖水平呈正相关。UCP2基因敲除小鼠体内胰岛素水平升高，杂合型(UCP2+/－)鼠的胰岛素分泌能力介于野生型(UCP2+/+)和基因敲除型(UCP2－/－)之间〔8，9〕。Krauss 等〔10，11〕的研究表明高血糖能上调胰岛细胞线粒体的UCP2表达，同时ROS的产生增加，进而抑制胰岛素的分泌，在协同高脂的环境下，ROS生成的增多诱导UCP2的表达增多，UCP2的超表达将进一步抑制胰岛素分泌，加重高血糖。本研究结果显示糖尿病大鼠血糖及胰岛素水平均升高，同时外周组织中UCP2mRNA表达增加。但也有研究〔12〕表明糖尿病病状态下机体外周组织内UCP2 mRNA的表达较正常机体下降。其结果与上述结果不尽相同可能与动物实验时间、实验方法、实验技术及样本量等有关。国内外的研究均已证实〔13～15〕LA对糖尿病大鼠血糖具有调节作用，本研究证实了高血糖可增加UCP2 mRNA的表达，认为高糖血症上调UCP2 mRNA的表达可能是机体用来限制血糖无限升高的一种适应机制，其机制尚不明确。同时也证实了UCP2是β细胞胰岛素分泌的一个重要的调节因子，认为可能是UCP2通过解耦联作用导致ATP合成减少进而出现ATP/ADP比值降低，使ATP敏感性K+通道(K+－ATP通道)关闭，出现细胞膜去极化，从而通过打开电压门控钙通道，导致Ca2+内流的增加，进而促进β细胞通过胞吐作用将胰岛素释放，机体为此所必须付出的代价是能量通过UCPs的作用以热能的形式被消耗，而不是以 ATP形式被储存，UCP2的这种质子传递作用能被细胞内的ADP抑制。

UCP2被认为是介导线粒体ROS的生成，最近的很多研究都证实UCP2是不同组织 ROS生成的调节器〔16～18〕，更有趣的是研究发现〔10，18，19〕，UCP2 可调节 ROS 的生成，同时 ROS 分子可激活UCP2，UCP2对 ROS的调节是一个负反馈。Li等〔20〕的研究发现，氧化应激可使胰岛β细胞和肥胖者肝细胞中UCP2表达增加，表达增高的UCP2可增强β细胞H2O2毒性的对抵抗力。上述研究表明UCP2可调节ROS的生成，同时也显示UCP2的表达也受ROS分子的调节。众多的临床及动物研究已证实糖尿病状态下机体抗氧化能力下降，氧化应激明显增强〔21～25〕。本研究提示糖尿病状态下机体的氧化－抗氧化系统失调，抗氧化能力明显下降，氧化应激明显增强，与上述研究结果一致。LA可以通过调节氧化系统与抗氧化系统之间的平衡，改善糖尿病机体的氧化应激水平，并且本研究潜在的提示了氧化应激水平与UCP2 mRNA的表达水平两者是一个负反馈。

1 Bullen JW Jr，Ziotopoulou M，Ungsunan L，et al.Short－term resistance to diet－induced obesity in A/J mice is not associated with regulation of hypothalamic neuropeptides〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2004;287(4):E662－70.

2 Vettor R，Fabris R，Serra R，et al.Changes in FAT/CD36，UCP2，UCP3 and GLUT4 gene expression during lipid infusion in rat skeletal and heart muscle〔J〕.Int J Obes Relat Metab Disord，2002;26(6):838－47.

3 Kukidome D，Nishikawa T，Sonoda K，et al.Activation of AMP－activated protein kinase reduces hyperglycemia－induced mitochondrial reactive oxygen species production and promotes mitochondrial biogenesis in human umbilical vein endothelial cells〔J〕.Diabetes，2006;55(1):120－7.

4 Yang RL，Le G，Li A，et al.Effect of antioxidant capacity on blood lipid metabolism and lipoprotein lipase activity of rats fed a high－fat diet〔J〕.Nutrition，2006;22(11－12):1185－91.

5 Yang RL，Li W，Shi YH，et al.Lipoic acid prevents high－fat diet－induced dyslipidemia and oxidative stress:a microarray analysis〔J〕.Nutrition，2008;24(6):582－8.

6 Aubert J，Champigny O，Saint－Marc P，et al.Up－regulation of UCP－2 gene expression by PPAR agonists in preadipose and adipose cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1997;238(2):606－11.

7 Hjeltnes N，Fernström M，Zierath JR，et al.Regulation of UCP2 and UCP3 by muscle disuse and physical activity in tetraplegic subjects〔J〕.Diabetologia，1999;42(7):826－30.

8 Joseph JW，Koshkin V，Zhang CY，et al.Uncoupling protein 2 knockout mice have enhanced insulin secretory capacity after a high－fat diet〔J〕.Diabetes，2002;51(11):3211－9.

9 Lee SC，Robson－Doucette CA，Wheeler MB.Uncoupling protein 2 regulates reactive oxygen species formation in islets and influences susceptibility to diabetogenic action of streptozotocin〔J〕.J Endocrinol，2009;203(1):33－43.

10 Krauss S，Zhang CY，Scorrano L，et al.Superoxide－mediated activation of uncoupling protein 2 causes pancreatic beta cell dysfunction〔J〕.J Clin Invest，2003;112(12):1831－42.

11 Langin D.Diabetes，insulin secretion，and the pancreatic beta－cell mitochondrion〔J〕.N Engl J Med，2001;345(24):1772－4.

12 吴德红，王凤杰，邓 娟，等.黄芪多糖对实验性2型糖尿病大鼠肝脏组织中解耦联蛋白2表达的影响〔J〕.现代中西医结合杂志，2009;18(29):552－4.

13 da Silva Xavier G，Leclerc I，Varadi A，et al.Role for AMP－activated protein kinase in glucose－stimulated insulin secretion and preproinsulin gene expression〔J〕.Biochem J，2003;371(3):761－74.

14 Targonsky ED，Dai F，Koshkin V，et al.α－Lipoic acid regulates AMP－activated protein kinase and inhibits insulin secretion from beta cells〔J〕.Diabetologia，2006;49(7):1587－98.

15 李艳英，耿厚法，班 博.α－硫辛酸对STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、血脂及氧化应激水平的调节作用〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(11):1534－6.

16 González－Barroso MM，Giurgea I，Bouillaud F，et al.Mutations in UCP2 in congenital hyperinsulinism reveal a role for regulation of insulin secretion〔J〕.PLoS One，2008;3(12):e3850.

17 Degasperi GR，Romanatto T，Denis RG，et al.UCP2 protects hypothalamic cells from TNF－alpha－induced damage〔J〕.FEBS Lett，2008;582(20):3103－10.

18 Giardina TM，Steer JH，Lo SZ，et al.Uncoupling protein－2 accumulates rapidly in the inner mitochondrial membrane during mitochondrial reactive oxygen stress in macrophages〔J〕.Biochim Biophys Acta，2008;1777(2):118－29.

19 Echtay KS，Murphy MP，Smith RA，et al.Superoxide activates mitochondrial uncoupling protein 2 from the matrix side.Studies using targeted antioxidants〔J〕.J Biol Chem，2002;277(49):47129－35.

20 Li LX，Skorpen F，Egeberg K，et al.Uncoupling protein－2 participates in cellular defense against oxidative stress in clonal beta－cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2001;282(1):273－7.

21 Hink U，Li H，Mollnau H，et al.Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus〔J〕.Circ Res，2001;88(2):E14－22.

22 Nuttall SL，Dunne F，Kendall MJ，et al.Age－independent oxidative stress in elderly patients with non－insulin－dependent diabetes mellitus〔J〕.QJM，1999;92(1):33－8.

23 Hsu RM，Devaraj S，Jialal I.Autoantibodies to oxidized low－density lipoprotein in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Clin Chim Acta，2002;317(1－2):145－50.

24 Seghrouchni I，Drai J，Bannier E，et al.Oxidative stress parameters in typeⅠ，type Ⅱ and insulin－treated type 2 diabetes mellitus;insulin treatment efficiency〔J〕.Clin Chim Acta，2002;321(1－2):89－96.

25 Shin CS，Moon BS，Park KS，et al.Serum 8－hydroxy－guanine levels are increased in diabetic patients〔J〕.Diabetes Care，2001;24(4):733－7.