儿茶素对放射性损伤大鼠肺组织TNF－α表达水平的影响

石卫民 高 蕾 陈龙华 宋维舒 (南方医科大学南方医院放疗科，广东 广州 5055)

儿茶素，分子式C15H14O6，存在于茶叶、苹果、葡萄、红酒和可可等膳食中，包括4种单体成分:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)，具有抗衰老、抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡等作用〔1～4〕。有研究发现其单体及混合体对不同组织具有不同程度的辐射防护作用，其研究见于外周血淋巴细胞、小肠绒毛细胞等〔5～8〕，而目前尚未见对于放射性肺损伤的研究。本实验拟研究儿茶素混合体对放射性肺损伤的影响和对照射后肺组织TNF－α表达的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雌性Wistar大鼠，购自广州省实验动物中心，体重(200±20)g。供试前在SPF级清洁动物房常规饲养3 d，观察无异常者进入实验。

1.2 茶儿茶素混合品 儿茶素混合体(主要EGCG 50%～60%，EGC 30%，余为ECG和EC)购自广东省中药研究所，纯度95%以上。

1.3 照射条件 使用美国瓦里安公司的VARIAN 2300C直线加速器(广州中医药大学广东省中医院放疗科)产生的6 mV X线。照射时大鼠清醒状态俯卧于体模固定板上，用瓦里安直线加速器6 mV X射线等距离照射全肺，照射野上界平大鼠腋窝，下界平胸骨剑突，左、右至胸廊外侧，大鼠全身其余部分用挡铅屏蔽。源皮距为 100 cm，计算点深度为 2 cm，剂量率为320 cGy/min，一次性照射剂量为15 Gy。

1.4 方法 实验大鼠随机分为4组，每组10只。儿茶素+照射组动物每日予儿茶素，100 mg/kg腹腔注射，从照射前一天开始，直至照射后第6天，共7 d;单纯儿茶素组100 mg/kg腹腔注射7 d。空白对照组及单纯照射组每日腹腔注射生理盐水20 ml/kg。实施照射后2 w、6 w，各组动物随机取5只，处死后分别取肺组织在10%中性甲醛缓冲液中固定准备制作病理蜡块。①HE染色光镜观察:由病理科医生在显微镜下观察肺组织病理学变化(盲法)。②肺组织TNF－α蛋白免疫组化染色检测:一抗为abcan生物技术公司兔抗鼠多克隆抗体，抗体工作浓度为1∶2 000;二抗为福州迈新公司通用试剂盒，按试剂盒说明书操作。每张切片在400倍视野下选取10个有代表性、无重叠、不连续视野，盲法计数阳性细胞，取平均数。

1.5 统计学处理 各组动物TNF－α染色阳性的细胞数比较用t检验，用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 肉眼观 大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可见单纯照射组小鼠的肺组织表面明显点片状充血，出血病灶，而在照射+儿茶素组的肺组织仅呈充血状，未见明显出血病灶。

2.2 组织学结果 单纯照射组动物肺损伤较重，包括肺泡内出血，肺泡、支气管上皮、血管的改变，血管周围水肿较明显;特别是在单纯照射组动物中发现由于肺泡出血引起肺实质灶性实变和肺泡上皮水肿;相比之下，照射+儿茶素组动物的肺泡间隔增厚、上皮细胞损伤、血管改变的程度都较单纯照射组减轻。见图1。

2.3 免疫组化结果 ①镜下观:空白对照组和单纯儿茶素组，在其支气管上皮中TNF－α呈不均一表达，在肺实质中少量肺泡巨噬细胞呈阳性表达，而血管内皮和肌层均呈阴性。单纯照射组和照射+儿茶素组大鼠，2 w即可见肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡细胞呈阳性表达，肺实质中有大量阳性巨噬细胞聚集在血管外膜周围，照射后6 w时整个肺实质布满大量阳性巨噬细胞。②阳性细胞计数:空白对照组和单纯儿茶素组阳性细胞数相对较低，为(18±4)及(20±8)个，照射后2 w时单纯照射组的阳性细胞数为(96±21)个，较上述两组明显增高，有统计学意义(P＜0.01);照射+儿茶素组的细胞数为(38±14)个，显著低于单纯照射组(P＜0.01)。照射后6 w时单纯照射组的阳性细胞数为(79±16)个，照射+儿茶素组的细胞数为(26±14)个，仍然显著低于单纯照射组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1 各组大鼠肺组织组织学改变(HE，×100)

图2 各组大鼠肺组织TNF-α表达(×200)

3 讨论

电离辐射作用于生物机体时，最初的事件就是通过直接作用使组织产生DNA损伤或通过间接作用产生自由基(包括OH－，O－2等)，自由基作用于细胞成分(如膜、胞浆体和DNA等)，细胞成分损伤的信号启动细胞信号传导系统，导致一系列细胞因子的表达，并最终导致细胞死亡、增殖或细胞外基质蛋白产生等事件，产生临床辐射损伤。研究证实，儿茶素清除机体过量自由基的作用对染色体具有保护作用。Nair等〔8〕以EC处理大鼠1 h后全身照射γ射线4 Gy，用碱性彗星分析法测定其外周血淋巴细胞的DNA链断裂情况，发现EC减轻了外周血淋巴细胞的DNA损伤。Yamamoto〔5〕把正常人唾液腺上皮细胞和口腔鳞状细胞癌细胞用EGCG处理后再用γ射线照射，用MTT法和5－溴脱氧尿核苷核素掺入法检测，发现EGCG对于正常人唾液腺上皮细胞的辐射损伤具有防护效果。Matuo〔9〕用MTT法研究茶水提取物处理后巨噬细胞进行照射的效应，发现其对巨噬细胞有辐射保护作用。高能射线所致的生物效应有2/3是因间接作用而发挥作用，因此儿茶素的自由基清除作用使其有可能发展成为一个好的辐射防护剂，但是目前对于儿茶素辐射防护的体内研究较少。

本研究发现大鼠肺单剂量照射15 Gy后2 w出现肺组织严重充血、渗出和水肿，而经儿茶素处理后再进行照射的大鼠肺组织肺泡间隔和间质水肿有效减轻。Lee等〔7〕研究发现四种儿茶素单体都对实验动物具有辐射防护作用，而四种单体混合物的放射防护作用强过任何一种单体。

放射性肺损伤，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纤维化，是胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理的常见并发症，是一个有多种细胞参与、多种细胞因子调控的复杂过程。当肺脏受到照射后，分泌介导放射性肺损伤发生的细胞因子，包括TNF－α、IL－1α、IL－1β、IL－4、MCP－1 以及 TGF－β、PDGF、IGF－1、bFGF 等，介导了后一系列损伤事件发生，产生病理组织学改变〔10〕。TNF－α是调节细胞因子网络的启动因子，介导损伤后起初的炎性反应，如改变血管内皮的通透性，增加血管渗出，刺激中性粒细胞等炎性细胞的趋化反应，加强单核巨噬细胞的吞噬功能;同时，TNF－α还具有促进成纤维细胞生长及刺激 IL－1、IL－6等其他细胞因子释放的作用〔11，12〕。本研究发现，大鼠肺单剂量照射15 Gy后2 w肺组织中TNF－α即明显升高，直到照射后6 w继续升高，而儿茶素+照射组的大鼠肺组织中TNF－α较照射组减低，说明儿茶素可能通过下调TNF－α的表达减轻了放射性肺炎的程度。

本研究证实儿茶素对大鼠照射肺有一定保护作用，可能由于其自由基的清除作用，减少了受照射组织的DNA损伤，从而通过降低肺组织TNF－α的分泌而减少了放射性肺损伤，是否有其他细胞因子分泌的改变尚不清楚，各种儿茶素单体对大鼠肺组织的放射防护情况也有待进一步研究。

1 Jun X，Deji S，Ye L，et al.Comparison of in vitro antioxidant activities and bioactive components of green tea extracts by different extraction methods〔J〕.Int J Pharm，2011;408(1－2):97－101.

2 Relja B，Töttel E，Breig L，et al.Effects of green tea catechins on the proinflammatory response after haemorrhage/resuscitation in rats〔J〕.Br J Nutr，2011;4(1):1－7.

3 Yang WH，Fong YC，Lee CY，et al.Epigallocatechin－3－gallate induces cell apoptosis of human chondrosarcoma cells through apoptosis signal－regulating kinase 1 pathway〔J〕.J Cell Biochem，2011;112(6):1601－11.

4 Xu Y，Zhang JJ，Xiong L，et al.Green tea polyphenols inhibit cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion via modulating oxidative stress〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(8):741－8.

5 Yamamoto T，Staples J，Wataha J，et al.Protective effects of EGCG on salivary gland cells treated with gamma－radiation or cis－platinum(Ⅱ)diammine dichloride〔J〕.Anticancer Res，2004;24(5A):3065－73.

6 Katiyar SK，Mukhtar H.Green tea polyphenol(－)－epigallocatechin－3－gallate treatment to mouse skin prevents UVB－induced infiltration of leukocytes，depletion of antigen－presenting cells，and oxidative stress〔J〕.J Leukoc Biol，2001;69(5):719－26.

7 Lee HJ，Kim JS，Moon C，et al.Modification of gamma－radiation response in mice by green tea polyphenols〔J〕.Phytother Res，2008;22(10):1380－3.

8 Nair CK，Salvi VP.Protection of DNA from gamma－radiation induced strand breaks by Epicatechin〔J〕.Mutat Res，2008;650(1):48－54.

9 Matuo Y，Nishijima S，Ikeda T，et al.Radical scavenging effect of naturally－occurring epigallocatechin gallate against oxidative damage caused by gamma－ray radiation〔J〕.Radioisotopes，2008;57(12):1179－87.

10 赵路军，王绿化，王小震，等.血液中TGF－p，IL－6及ACE含量在预测放射性肺炎中的价值〔J〕.中华放射肿瘤学杂志，2006;15(3):217－22.

11 张 海，王炳胜，刘秀芳，等.益气活血中药对大鼠 TGF－β1、TNF－α的影响〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2009;29(4):383－5.

12 张瑾熔，刘珊珊，吕 茵，等.血浆中TNF－α、IL－6、ACE水平及 DVH参数与放射性肺炎发生的相关性研究〔J〕.中国癌症杂志，2010;20(6):440－3.