瘦素预处理对小鼠心肌冷/热缺血再灌注损伤的差异性

吕祥威 徐彤彤 武 琦 覃 泱 (桂林医学院附属医院特需病区，广西 桂林 541001)

心肌有瘦素及瘦素受体表达，表明心肌是瘦素直接作用的靶器官，瘦素有促进心肌再塑的作用，而瘦素处理能减轻心肌缺血再灌注损伤(IRI)程度，起到心肌保护作用〔1〕。心肌冷IRI是指心脏移植领域中的心脏冷保存以及移植后的供心热灌注引起的损伤。心肌热IRI是指阻断的冠状动脉再通后出现的心脏功能、代谢及结构上的损伤。由于心脏移植的冷IRI不可避免，并且心肌IRI是心脏器官移植损伤的主要因素，因此如何减轻移植心脏的心肌IRI成为了临床心脏移植领域中的重要课题〔2，3〕。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性C57BL/6小鼠30只，8～10周龄，体重20～25 g。随机分为3组:(1)心肌冷IRI组:瘦素预处理〔术前30 min予腹腔注射重组瘦素(美国R＆D Systems公司，剂量为50 μg/kg〕。后行同种间小鼠腹部心脏移植，供体置于4℃UW液中保存6小时。(2)心肌热IRI组:本组小鼠于MIRI术前30 min予腹腔注射重组瘦素。(3)心肌IRI模型组。分别于术后6 h收获移植心脏与血清标本。

1.2 小鼠腹部心脏移植模型的制作 (1)小鼠心脏移植模型制作:手术采用乙醚吸入麻醉，供体小鼠麻醉满意后固定，迅速沿正中切口进入腹腔，显露下腔静脉，经下腔静脉肝素化后，剪开腹主动脉放血并迅速剪开膈肌，沿两侧腋前线剪断肋骨直至颈部，剪开心包，将胸腺组织向上推移，充分显露心脏。充分游离主动脉和肺动脉，于头臂干分支近侧将主动脉横断;在肺动脉后方将肺静脉连同心脏后的组织(包括下腔静脉和上腔静脉)一并结扎并切断;然后将肺动脉在分叉处横断，取下供心，置于4℃ UW液中保存6 h。受体小鼠用上法麻醉满意后固定。消毒后经正中切口进腹。腹壁切口两侧采用自制拉钩牵拉固定。剪开小肠与直肠间的系膜，将小肠向左上腹推移，充分显露下腔静脉和腹主动脉。稍加游离后阻断下腔静脉及腹主动脉血流。于腹主动脉及下腔静脉前壁作平行纵行小切口，分别行供心主动脉和受体腹主动脉端侧吻合及肺动脉和下腔静脉端侧吻合。动脉吻合方法为:将供心置于小鼠右侧腹腔，于吻合口两端各作一牵引线，自尾侧一针连续缝合至头侧打结固定后，翻转心脏至左侧，行后壁连续缝合，与尾侧牵引线打结固定。静脉吻合方法为一针连续缝合后壁先缝法，吻合至对侧时自身打结固定一次。吻合完毕后，先开放远端血流，后松开近端阻断带。将肠管复位后，分两层连续缝合关闭腹腔。(2)小鼠缺血/再灌注(MIRI)模型制作:结扎小鼠冠状动脉左前降支，人为造成小鼠急性心肌缺血。小鼠吸入乙醚麻醉，切开颈部正中皮肤，钝性分离肌肉至气管。PE-90经口气管插管接小鼠人工呼吸机。颈部各组织逐层缝合。小鼠冠脉左前降支开胸结扎:在胸骨左侧1.5～2.0 mm处切开皮肤，皮下组织钝性分离，暴露肋骨，钝性分离第4肋间隙肋间肌。使用拉钩拉开胸壁，暴露心脏，小心剪开心包膜，轻压住心脏。进针(8-0丝线)在左心耳下缘1～2 mm处，深度约1 mm，出针方向斜向右上方肺动脉圆锥出，针距约2 mm，留线经PE-10管结扎左前降支近端。缺血30 min后松开线结，纪录再灌注时间。

1.4 移植心脏组织形态学分析 分别于手术后6 h收获心脏标本。供心组织行常规HE染色，按文献报道的标准，本试验组标本的组织病理学损伤半定量及中性粒细胞计数由同一病理科医生行双盲评定。

1.5 血清及心肌瘦素测定 心脏取血0.5 ml，摇匀，抗凝，4℃，1 000 r/min低温离心8 min，分离血清置于－70℃冰箱保存待测。左室心底部取心肌，生理盐水0.5 ml加入50 mg心肌中，低温匀浆液中加抑肽酶，煮沸10 min，3 000 r/min离心，将上清液保存于－20℃冰箱中待测。

1.6 血清炎性细胞因子白介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平及心肌髓过氧化物酶(MPO)活性测定 血清IL-6，IL-1β，TNF-α水平采用 ELISA法检测，心肌中性粒细胞活性行MPO活性检测，操作按试剂盒说明。血清心肌肌钙蛋白I(TnI)利用美国Beckman Coulter公司的Access临床生化分析系统，采用化学发光法进行定量测定，试剂盒由南京强欣生物技术有限公司生产。

1.8 统计学处理 采用统计软件SPSS13.0进行统计学分析，数据表示为，两组均数比较应用独立样本t检验，多组间均数比较采用方差分析。

2 结果

2.1 瘦素预处理显著性改善移植小鼠移植心脏心肌损伤MIRI组心肌组织结构紊乱，片状局灶性出血坏死，并有大量中性粒细胞聚集;而瘦素预处理组上述病变明显改善，结构紊乱，虽然有坏出血死，但是中性粒细胞聚集明显减少(见图1)。瘦素预处理明显降低心脏移植组和MIRI组6 h血清心肌TnI的水平〔(42.8±2.1)vs(43.2±1.5)、(79.1±1.3)ng/ml〕;但是心脏移植组和瘦素预处理组无统计学意义(P＞0.05)。

图1 各组6 h后小鼠移植心脏病理学改变(HE，×400)

2.2 瘦素预处理可以明显减轻心肌冷/热IRI的炎性细胞因子水平 与MIRI组比较，心脏移植组和瘦素预处理组6 h血清炎性细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6表达明显降低，心肌 MPO水平同样降低显著(P均＜0.01)。但是，心脏移植组和瘦素预处理组之间变化无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组炎性细胞因子TNF-α，IL-1 β，IL-6及心肌MPO水平检测结果(n=10，)

表1 各组炎性细胞因子TNF-α，IL-1 β，IL-6及心肌MPO水平检测结果(n=10，)

与MIRI组比较:1)P＜0.01

组别TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)MPO(ng/mg)76.1±1.2 27.8±3.1 621.1±113.2 35.1±6.3心脏移植组 35.3±5.91)14.2±2.21)335.1±36.11)17.5±4.31)瘦素预处理组 31.2±6.21)15.2±3.11)315.2±34.91)16.7±3.91)MIRI组

3 讨论

我们的前期研究显示:高瘦素水平实际上参与了大鼠AMI心肌损伤过程及临床心肌梗死病人的损伤机制〔4，5〕。尽管冷/热IRI的机制可能不完全相同，但是本研究结果提示:瘦素预处理对心肌冷/热IRI均有明显的保护作用。心肌冷/热IRI是一个复杂的病理生理变化过程，中性粒细胞在MIRI中起关键性的损伤作用，过度的炎性反应无疑是参与损伤的重要环节〔6，7〕。本研究提示瘦素预处理对小鼠心肌冷/热IRI之间的保护作用没有统计学差异。

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2 Jahania MS，Sanchez JA，Narayan P，et al.Heart preservation for transplantation:principles and strategies〔J〕.Ann Thorac Surg，1999;68(5):1983-7.

3 Zheng X，Lian D，Wong A，et al.Novel small interfering RNA-containing solution protecting donor organs in heart transplantation〔J〕.Circulation，2009;120(12):1099-107.

4 徐彤彤，阳跃忠.急性心肌梗死患者血清瘦素水平的变化及其临床意义〔J〕.临床内科杂志，2007;24(2):106-8.

5 徐彤彤，戴 玲.瘦素与急性心肌梗死溶栓后ST段变化的关系探讨〔J〕.广西医科大学学报，2007;24(3):403-5.

6 Jordan JE，Zhao ZQ，Vinten-Johansen J.The role of neutrophils in myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Cardiovasc Res，1999;43(4)860-78.

7 姚艳敏，徐彤彤，武 琦，等.瘦素对兔急性肺栓塞后TNF-α、IL-1β、Hs-CRP水平的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(20):3977-8.