芡实提取物对D－半乳糖衰老小鼠学习记忆障碍的改善作用

沈 蓓 吴启南 陈 蓉 王新胜 袁冬平 伍城颖 陈广云

(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046)

芡实具有益肾固精、补脾止泻的功效，素有“水中人参”和“水中桂圆”的美誉。芡实水和乙醇提取物有较强的抗氧化和清除OH·自由基和· 自由基的作用〔1，2〕，这为其能延缓衰老提供了基本依据。芡实化学成分复杂，含氨基酸〔3〕、多糖〔4〕、多酚〔5〕、黄酮〔6〕、不饱和脂肪酸〔7〕、微量元素〔8〕等多种成分，但有关其延缓衰老有效部位的报道甚少。本实验采用D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型，分别灌胃芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物高低剂量溶液，观察小鼠行为和多项脑指标变化的方法，评价其延缓衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 小鼠旷场装置(上海软隆科技发展有限公司);SLY-WMS型Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司);FSH-2A可调高速电动匀浆机(金坛市金南仪器厂);LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机(南京晓晓仪器设备有限公司);Powerwave X340全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司);芡实购于北京中葛绿元科技有限公司，经南京中医药大学药学院中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为为睡莲科植物芡Euryale ferox Salisb.的干燥成熟种仁。芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物由实验室自行制备;D-半乳糖(上海宝曼生物有限公司);一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);清洁级昆明种小鼠104只，雄性，体质量18～22 g，合格证号:SCXK(苏)2009-0002，江苏大学实验动物中心提供。实验中有小鼠死亡。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制备 芡实乙醇提取物的制备:称取芡实整粒2 000 g，用8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，减压浓缩为浸膏。芡实乙酸乙酯提取物的制备:同上述乙醇提取物的制备，减压浓缩后的浸膏用水混悬，以少量多次原则，乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，干燥备用。芡实正丁醇提取物的制备:称取芡实整粒2 000 g，用8倍量水饱和正丁醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，减压浓缩为浸膏。临用前用生理盐水配成所需浓度。

1.2.2 动物分组及给药 将昆明种小鼠随机分为8组，每组13只，分别为对照组、模型组、芡实乙醇提取物高、低剂量(500、250 mg·kg－1·d－1)组、芡实乙酸乙酯提取物高、低剂量(300、150 mg·kg－1·d－1)组、芡实正丁醇提取物高、低剂量(100、50 mg·kg－1·d－1)组，以上三种提取物高、低剂量分别换算成生药量均一致。模型组和给药组每日上午腹腔注射D-半乳糖500 mg·kg－1·d-1，空白组注射等量生理盐水，下午给药组分别灌胃相应浓度的药物，空白组和模型组分别灌胃等量的生理盐水，给药量均为0.1 ml/10 g，连续42 d，并用旷场和Morris水迷宫装置测试模型制备的成功。

1.2.3 旷场实验 各组小鼠给药42 d后，将其置于旷场中央，开始计时，用Anymaze动物行为学视频分析系统记录并分析小鼠90 s内的自主探究情况，包括运行轨迹、在周边区和中央区的运动速度、总区域跨行次数等。每实验完1只小鼠将旷场箱打扫干净，再进行下一只的实验。

1.2.4 Morris水迷宫实验 定位航行实验:从造模和给药第38天开始，每日于注射和灌胃后进行训练，上、下午各1次，历时5天。将小鼠面向池壁，从平台对角象限固定入水点放入水中，记录120 s内找到平台的时间，如未能找到平台，则将其引至上面停留10 s，再放回笼中，潜伏期记为120 s。空间探索实验:定位航行实验结束后24 h，移出平台，仍从平台对角象限固定入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录120 s内穿越原平台位置的次数，以衡量小鼠对水迷宫记忆的获取能力。

1.2.5 脑组织蛋白质、NOS、GSH-Px、AChE活性的测定 实验结束后，取脑组织冰浴研磨，并用冷生理盐水制成10%脑匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液按试剂盒方法，测定脑组织中蛋白质、NOS、GSH-Px、AChE 活性。

2 结果

2.1 旷场实验 与对照组相比，模型组小鼠的运动速度及总跨越次数均明显降低(P＜0.01)，与模型组相比，芡实乙醇、正丁醇提取物高低剂量组、乙酸乙酯提取物高剂量组均可使衰老小鼠的运动速度及总跨越次数明显增加(P＜0.01)。见表1。

表1 芡实不同提取物对亚急性衰老小鼠旷场实验的影响()

表1 芡实不同提取物对亚急性衰老小鼠旷场实验的影响()

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P ＜0.01，下表同

13 19.89±8.28 9.03±1.46 19.29±4.00模型组 11 10.04±3.242) 4.05±0.962) 10.41±3.342)乙醇提取物高剂量组 13 18.48±7.544) 7.50±2.114) 18.65±4.434)乙醇提取物低剂量组 13 17.56±7.204)6.62±0.862)4)17.88±3.974)乙酸乙酯提取物高剂量组10 18.25±6.474)6.53±1.251)4)16.41±4.061)4)乙酸乙酯提取物低剂量组11 11.18±5.422) 5.13±1.342)13.53±4.962)3)正丁醇提取物高剂量组 13 18.60±5.574) 10.20±1.804)18.24±5.194)正丁醇提取物低剂量组 13 16.53±6.201)4)8.93±2.264) 17.00±5.124)对照组

2.2 水迷宫实验 各实验组潜伏期和穿越次数存在一定差异，模型组小鼠与对照组相比，潜伏期明显增加(P＜0.01)，穿越次数减少。其他各给药组与模型组相比，潜伏期均明显减少，且穿越次数明显增加(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

表2 芡实不同提取物对衰老小鼠定位航行和空间搜索实验的影响()

表2 芡实不同提取物对衰老小鼠定位航行和空间搜索实验的影响()

组别 n 平均潜伏期(s) 穿越原平台次数(次)13 47.97±12.32 4.83±1.72模型组 11 80.89±22.242) 1.33±0.52乙醇提取物高剂量组 13 42.49±16.834) 3.67±1.374)乙醇提取物低剂量组 13 45.04±9.774) 3.50±1.054)乙酸乙酯提取物高剂量组 10 43.83±12.764) 3.33±1.513)乙酸乙酯提取物低剂量组 11 46.61±15.654) 2.67±0.821)4)正丁醇提取物高剂量组 13 38.09±14.201)4) 4.08±1.804)正丁醇提取物低剂量组 13 43.78±14.814) 3.17±1.473)对照组

2.3 芡实不同提取物对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织NOS、GSH-Px、AChE活性的影响 与对照组相比，模型组小鼠脑组织NOS、AChE显著性下降或升高(P＜0.05)，GSH-Px活性升高(P＜0.01)。与模型组相比，芡实乙醇、正丁醇提取物高剂量组NOS活性升高(P＜0.05)，乙醇、正丁醇提取物高低剂量组、乙酸乙酯提取物高剂量组GSH-Px和AChE活性显著性升高或降低(P＜0.01)。见表3。

表3 芡实不同提取物对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织NOS、GSH-Px、AChE 活性的影响()

表3 芡实不同提取物对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织NOS、GSH-Px、AChE 活性的影响()

组别 n NOS(U/mg) GSH-Px(U/mg)AChE(U/mg)13 0.49±0.16 39.31±3.60 0.65±0.03模型组 11 0.24±0.081) 30.47±1.622) 0.80±0.061)乙醇提取物高剂量组 13 0.38±0.113) 40.04±1.494)0.52±0.061)4)乙醇提取物低剂量组 13 0.35±0.12 37.11±2.924) 0.58±0.044)乙酸乙酯提取物高剂量组10 0.33±0.12 38.00±1.324)0.52±0.012)4)乙酸乙酯提取物低剂量组11 0.26±0.091) 32.83±1.101) 0.66±0.013)正丁醇提取物高剂量组 13 0.39±0.103)51.16±1.462)4)0.48±0.101)4)正丁醇提取物低剂量组 13 0.36±0.17 40.89±0.674)0.54±0.022)4)对照组

3 讨论

本实验采用小鼠腹腔注射D-半乳糖的方法来建造亚急性衰老模型，其原理是在一定时间内连续注射 D-半乳糖，细胞内半乳糖浓度增高，经醛糖还原酶催化后还原成半乳糖醇，该物质不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱，氧自由基堆积，最终致机体衰老。旷场、Morris水迷宫的实验结果证实了芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物对亚急性衰老小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用。脑组织抗氧化相关酶测试显示以上三种提取物可以提高亚急性衰老小鼠脑组织NOS、GSH-Px活力，降低 AChE活力。两项实验结果有着明显的相关性，且芡实正丁醇提取物的作用优于乙醇和乙酸乙酯提取物。

NOS在体内能催化NO生成，NO既是一种神经递质，也是一种极不稳定的强氧化剂，但脑内过多的NO沉积会发生细胞毒性反应，这可能与诱生型NOS的过表达有关。本实验结果证实了小鼠在衰老过程中，NOS活力会下降且芡实三种提取物对衰老过程中NOS的活力起到了一定的影响作用。

GSH-Px是体内清除H2O2和许多过氧化物的重要酶〔9〕。实验数据显示，芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物能提高亚急性衰老小鼠脑组织GSH-Px的活力，并随剂量的增高，酶活性有增加的趋势，说明芡实以上三种提取物具有良好的抗氧化能力，能够增强机体对自由基的清除，从而在抗衰老过程中发挥作用。

AChE是在胆碱能神经元的突触处水解神经递质乙酰胆碱(ACh)的酶，AChE含量的变化在一定程度上可体现胆碱能神经元的功能活性。芡实三种提取物能够降低亚急性衰老小鼠脑组织AChE的活力，以提高小鼠脑内ACh的含量，这可能是芡实提取物改善衰老引起的学习记忆功能下降的机制之一。

本研究结果初步表明芡实乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物均能起到延缓衰老、改善学习记忆能力的作用，其机制可能是通过促进脂类过氧化物的清除，增强脑组织抗氧化能力，改善胆碱能系统在学习和记忆中的作用等实现。芡实作为一种药食两用的水产品，其药用价值正在被逐步挖掘。本实验结果显示了芡实脂溶性提取物在延缓衰老方面的作用，为芡实扩大临床应用提供了一定的实验基础。

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