眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑皮层组织IKKβ/NF-κB表达的影响

赵丹玉 王艳杰 苗兰英 曹 阳 王德山 (辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847)

眼针疗法是一种微针疗法，对40余种疾病具有疗效，特别对急性脑中风致残以及顽固性疼痛等眼针优势病种具有“针到病除”的独特效果。本课题建立大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型，观察眼针对于大鼠损伤侧脑皮质IKKβ及NF-κB蛋白表达的影响，研究眼针对于CIRI的作用机制，为“眼络于脑”的中医理论假说提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重280～320 g。购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物许可号:SCXK(沪)2008-0016。一抗 GAPDH、IKKβ 及 NF-κB 多克隆抗体、羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组与模型复制 60只大鼠以随机数字法分为正常组、假手术组、模型组和眼针组，剔除造模不成功以及死亡鼠，最终每组均为12只。正常组:常规喂养无任何施加因素。模型复制与成模标准:采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MACO)再灌注动物模型(右侧栓塞)。造模后参照Longa 5分制评分标准进行神经功能缺损评分。以神经功能缺损评分≥1分者视为造模成功。将造模成功的大鼠再随机分为模型组和眼针组。假手术组:术式与操作基本过程同模型组和眼针组，只是不进行大脑中动脉栓塞。模型组常规喂养，不给予任何刺激。眼针组在缺血再灌注即刻、造模术后12 h、24 h(即处死前)各眼针一次。

1.3 眼针取穴与刺法 取穴参照人体取穴定位法分别取:上焦区、下焦区、肝区、肾区;刺法:用35×25 mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2 mm处，平刺，由该区始点向该区终点方向，刺入0.3 cm，行捻转手法，留针30 min，15 min行针一次，时间1 min。

1.4 Western印迹检测IKKβ及NF-κB蛋白表达 于造模术后24 h每组各取6只鼠，麻醉后，迅速断头取脑，于无菌条件下冰上分离右侧皮层组织，加入相应体积的裂解液后匀浆，离心30 min，收集上清，检测各样本蛋白浓度。将样品和蛋白分子量标准分别加入胶孔内开始电泳。电泳完毕，半干式转印槽印迹约 1.5 h，封闭，37℃，2 h，加入适当稀释的一抗(IKKβ、NF-κB、GAPDH均以1∶100用封闭液稀释)，4℃过夜。TBST冲洗后加入1∶2 000稀释的酶标二抗，37℃，45 min。DAB显色。扫描硝酸纤维素膜上的条带，凝胶扫描系统进行吸光度积分分析(IOD)，以GAPDH作为内参，各组 IKKβ、NF-κB的蛋白表达强度IOD和内参GAPDH的蛋白表达强度IOD比值显示各组IKKβ、NF-κB 的蛋白表达变化。

2 结果

2.1 眼针对CIRI模型大鼠一般状态影响 正常组及假手术组大鼠，无神经功能缺损体征出现，根据神经功能缺损评分标准进行评分，平均为0分。模型组及眼针组大鼠术中死亡7只，另外还有5只大鼠神经功能缺损不明显，即将造模成功的大鼠随机分为模型组和眼针组各12只。造模成功的大鼠苏醒后出现明显的不能完全伸展对侧前爪、向对侧转圈及向对侧倾倒等神经功能缺损症状。术后24 h，模型组动物神经功能缺损症状随时间延长逐渐加重，神经功能缺损评分具有明显的上升趋势;眼针组神经功能缺损症状加重不明显，显示出眼针治疗的脑保护作用。

2.2 眼针对CIRI模型大鼠大脑皮层组织IKKβ、NF-κB蛋白表达影响 通过对免疫印迹的结果进行吸光度积分分析，如图1、表1所示，正常组及假手术组大鼠右侧大脑皮层组织IKKβ、NF-κB(p65)蛋白均表达较少，二者之间没有显著差异(P＞0.05);同正常组与假手术组相比较，CIRI模型组 IKKβ、NF-κB(p65)均呈现明显高表达(P＜0.01);而眼针组表达较模型组明显下降(P＜0.05)。

表1 眼针对CIRI模型大鼠缺血侧大脑皮层组织IKKβ、NF-κB蛋白表达的影响()

表1 眼针对CIRI模型大鼠缺血侧大脑皮层组织IKKβ、NF-κB蛋白表达的影响()

与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.052

6 0.16±0.01 0.18±0.02假手术组 6 0.16±0.01 0.17±0.03模型组 6 0.41±0.021) 0.33±0.031)眼针组 6 0.33±0.022) 0.24±0.042)/GAPDH正常组组别 n IKKβ/GAPDH NF-κB(p65)

图1 IKKβ、GAPDH、NF-κB(p65)蛋白印迹图

3 讨论

NF-κB广泛存在于真核细胞内，是一种转录因子，能与多种基因启动子或增强子序列的特定位点发生特异性结合而促进转录。抑制蛋白IκB是NF-κB的抑制剂。静息状态下，能与NF-κB二聚体结合形成三聚体形式，将NF-κB限制在细胞质中，使其不能入核与DNA结合。IKK是一个大的蛋白激酶复合体，其催化亚基IKKα和IKKβ是这个酶复合体的重要组成成分。具有活性的IKK可以催化其底物IκB磷酸化，进而降解。当外界环境的刺激时，IKK激活，IκB降解，失去抑制蛋白抑制作用的NF-κB具有了活性，进入细胞核，这时的NF-κB还会同时与大量的核蛋白发生反应。这些核蛋白有的本身即是转录因子，有的是辅助因子。这样通过NF-κB本身或者协同其他与之反应的核蛋白，作用于结构基因的调控序列，促进转录。NF-κB的活化可以促进大量炎症因子的转录，炎症反应的发生与其活化密切相关。IKKα和IKKβ由于对IκB作用位点的差异，IKKβ/NF-κB 途径被称为经典途径，而 IKKα/NF-κB 途径为旁路途径。

CIRI是一个多环节多因素的复杂的病理生理过程。其发病机制目前也没有完全研究清楚，但是炎症反应在脑缺血再灌注的发生发展中起重要作用，炎症反应能加重缺血半影区转变为梗死中心区〔1〕。IKKβ/NF-κB途径是炎症反应的关键信号转导通路。近年来，对于NF-κB的表达与脑损伤之间关系有大量的研究报道〔2～6〕。CIRI时脑梗死区域 NF-κB 表达增加，而且NF-κB的表达水平与脑梗死体积之间有显著的相关性。本研究前期实验证明模型组缺血侧脑组织炎性反应明显增强，炎性因子水平显著增高，本实验证明模型组缺血侧脑组织IKKβ及NF-κB的表达同正常组及假手术组相比较明显升高，同以往的研究结果一致，我们可以推断出缺血再灌注的刺激促进了脑组织IKKβ的表达，大量的IKKβ作用于IκB，使其磷酸化并降解，NF-κB脱离了IκB的抑制具有了活性，进入细胞核促进炎性因子的表达，加重了炎症反应，加重损伤。眼针组大鼠缺血侧脑组织IKKβ及NF-κB的表达同模型组相比较明显下降，说明眼针能够降低IKKβ的表达，从而将NF-κB限制在细胞质内，并抑制其表达，实现抑制炎性反应，减轻损伤的目的。这可能是眼针治疗CIRI的重要机制之一。

1 李晓昶，白宏英，曾志磊，等.乌司他丁降低脑缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子-α的机制〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(2):332-4.

2 封 菲，丁美萍.脑缺血再灌注后实验大鼠核因子kappaB的变化〔J〕.心脑血管病防治，2008;8(4):239-40.

3 Williams AJ，Hale SL，Moffett JR，et al.Delayed treatment with MLN519 reduces infarction and associated neurologic deficit caused by focal ischemic brain injury in rats via antiinflammatory mechanisms involving nuclear factor-kappa B activation，gliosis，and leukocyte infiltration〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2003;23(1):75-87.

4 Stephenson D，Yin T，Smalstig EB，et al.Transcription factor nuclear factor-kappa B is activated in neurons after focal cerebral ischemia〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2000;20(3):592-603.

5 Shen W，Zhang C，Zhang G.Nuclear factor kappa B activation is mediatedby NMDA and non-NMDA recepter and L-type voltagegated CA2+channel follow severe global ischemia in rat hippocampus〔J〕.Brain Res，2002;933(1):23-30.

6 Nurmi A，Lindsberg PJ，Koistinaho M，et al.Nuclear factor-kappa B contributes to infarction after permanent focal ischemia〔J〕.Stroke，2004;35(4):987-91.