幽门螺杆菌感染对胃癌组织Runx3、iNOS蛋白表达及患者生存率的影响

赵永勋 李玉民 关泉林 赵 鹏 韩 俭 曹 农 冯 颖

(兰州大学第一医院肿瘤外科，甘肃 兰州 730000)

Runx3基因是一种新发现的定位于染色体1p36的抑癌基因，在细胞生长发育过程中起重要作用，Runx3表达缺失与胃癌发生发展关系密切〔1〕。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是重要的炎症因子，其所产生的一氧化氮(NO)在胃癌发生发展中起着重要的作用〔2〕。流行病学调查显示，胃癌的发生与幽门螺杆菌(HP)感染密切相关〔3〕。Katayama等〔4〕最近研究发现，HP 诱导巨噬细胞产生NO，NO引起胃上皮细胞Runx3甲基化发生，这种甲基化作用能够被特异性的iNOS抑制剂所逆转，HP通过NO介导诱导Runx3甲基化发生，导致Runx3蛋白低表达，从而导致胃癌发生，NO在此过程中发挥中枢角色。本研究对胃癌组织中Runx3、iNOS蛋白表达和HP感染进行检测，探讨它们之间的相关性及与胃癌临床病理特征、患者生存之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集兰州大学第一医院肿瘤外科2004年6月至2005年12月86例病理确诊的原发性胃癌组织及相应的癌旁组织(距癌灶边缘＞5 cm，病理证实为非肿瘤组织)标本，病例均经术前内镜活检病理确诊，术后组织标本均经石蜡切片病理诊断证实，术前均未行放疗或化疗。男性52例，女性34例，平均年龄52(28～78)岁。组织分化程度:高中分化48例，低分化38例。有淋巴结转移54例，无淋巴结转移32例。浸润深度:浸润黏膜层9例，浸润肌层36例，浸润浆膜层29例，浸润浆膜外及远处12例。除ⅠA期之外其余患者术后均给予5-Fu为主4个周期全身静脉化疗。全部患者由本科随访室专人跟踪随访，具有完整的随访资料，均自手术日计生存和随访时间，至患者死亡或截止时间2009年6月，全部病例术后随访3～60个月。20例健康对照选自我院消化内科门诊同期排除肿瘤和消化系统疾病的健康体检者胃黏膜(胃镜取材)作为健康对照组，其中男性12例，女性8例，平均年龄49岁，取胃窦部黏膜组织3块，1块行快速尿素酶试验，1块速冻保存，1块石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 HP感染检测 所有患者术前胃镜活检时行快速尿素酶诊断法检测HP感染状况(福建三强公司试剂盒)，加入活检组织样本后黄色试纸1 min内变为樱红色为HP(+);石蜡包埋标本行Warthin-Starry染色法检测HP感染状况，HP呈棕褐色弯曲短杆状，散在或成堆分布为阳性，无HP检出者为阴性;二者均阳性为HP感染。

1.2.2 免疫组化SP法检测 兔抗人多克隆Runx3抗体(北京博奥森公司)，兔抗人多克隆iNOS抗体(北京中杉公司)，免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒(福州迈新公司)。组织标本离体后30 min内以10%甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm厚的切片，切片经脱蜡、酒精水化、微波抗原热修复;3%过氧化氢阻断后，滴加稀释的一抗Runx3抗体(1∶100)、iNOS抗体(1∶50)，4℃过夜后加二抗，DAB显色，苏木素复染，封片。用已知胃癌阳性作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 在临床病理资料双盲的条件下，分别由二位病理医师记数阳性染色细胞所占比例，独立判定结果，最后讨论核实确认。Runx3阳性表达为细胞核或细胞质染成黄色或棕黄色颗粒，iNOS的阳性表达为细胞质染成黄色或棕黄色颗粒;将切片中阳性细胞数＜10%记为阴性，≥10%记为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计数资料的比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关分析，生存率的计算和比较使用Kaplan-Meier限乘法和Log-rank检验。

2 结果

2.1 Runx3蛋白、iNOS蛋白在胃组织中的表达 Runx3阳性表达为细胞核或细胞质染成黄色或棕黄色颗粒，iNOS的阳性表达为细胞质染成黄色或棕黄色颗粒。在20例正常对照组织中，Runx3、iNOS蛋白的阳性表达率分别为100.00%(20/20)、10.00%(2/20)，86例癌旁组织中Runx3、iNOS蛋白的阳性表达率分别为89.53%(77/86)、16.28%(14/86)，86例胃癌组织中Runx3、iNOS蛋白的阳性表达率分别为43.02%(37/86)、72.09%(62/86)，Runx3、iNOS蛋白阳性表达胃癌组织与正常对照组织、癌旁组织差异具有统计学意义(P＜0.01)，癌旁组织与正常对照组织差异无统计学意义(P＞0.05)(图1)。

图1 胃癌组织Runx3和iNOS蛋白表达(SP，×400)

2.2 Runx3、iNOS蛋白阳性表达与胃癌临床病理特征的关系

Runx3蛋白阳性表达在肿瘤组织分化差(χ2=5.503，P=0.019)、浸润较深(χ2=6.048，P=0.014)、有淋巴结转移(χ2=4.614，P=0.032)的胃癌组织中表达缺失更明显，而与患者年龄、性别等临床病理特征无关(P＞0.05);iNOS蛋白阳性表达随肿瘤浸润加深(χ2=4.571，P=0.033)、有淋巴结转移(χ2=9.114，P=0.003)在胃癌组织中表达显著升高，而与患者年龄、性别及肿瘤组织分化等临床病理特征无关(P＞0.05)(表1)。

2.3 胃癌患者和正常对照HP感染的检测 健康对照组HP感染率40.0%(8/20)，胃癌组明显升高达67.4%(58/86)(χ2=5.201，P=0.023)。

2.4 胃癌Runx3蛋白、iNOS蛋白表达与HP感染的关系 86例胃癌患者中HP感染组Runx3蛋白阳性表达率为31.0%(18/58)，HP非感染组Runx3蛋白阳性表达率为67.9%(19/28)(χ2=10.445，P=0.001);iNOS蛋白在 HP感染组阳性表达率为100%(58/58)，在HP非感染组iNOS蛋白阳性表达率为14.3%(4/28)(χ2=68.959，P ＜0.001)。提示胃癌中 HP 感染升高iNOS蛋白表达，但却降低Runx3蛋白表达，HP感染影响胃癌Runx3、iNOS蛋白表达。

2.5 胃癌Runx3蛋白和iNOS蛋白表达的相关性 86例胃癌中Runx3蛋白和iNOS蛋白同为阳性者20例，同为阴性者7例，两者表达之间存在显著负相关(r=－0.349，P＜0.01)。

2.6 Runx3蛋白表达与胃癌患者生存率的关系 Kaplan-Meier生存曲线提示Runx3蛋白阴性表达组患者3年和5年生存率分别为45.1%和32.6%，Runx3蛋白阳性表达组患者分别为69.6%和60.9%，Log-rank检验提示Runx3蛋白阴性表达组患者生存率明显低于Runx3蛋白阳性表达组患者的生存率，胃癌组织中Runx3蛋白表达与患者生存率显著相关(χ2=7.361，P=0.007)。

2.7 iNOS蛋白表达与胃癌患者生存率的关系 Kaplan-Meier生存曲线提示iNOS蛋白阳性表达组患者3年和5年生存率分别为52.2%和42.9%，iNOS蛋白阴性表达组患者分别为65.5%和51.4%，Log-rank检验提示iNOS蛋白表达与患者生存无关，胃癌组织中iNOS蛋白表达与患者生存率无关(χ2=1.136，P=0.286)。

表1 胃癌Runx3蛋白、iNOS蛋白表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨论

Li等〔1〕研究发现有45% ～60%人胃癌细胞中有Runx3蛋白表达下降或缺失，Runx3基因敲除小鼠的胃黏膜上皮细胞对TGF-β诱导的细胞凋亡产生拮抗效应，提示Runx3蛋白表达缺失，使胃黏膜上皮细胞凋亡受到抑制，从而引起胃黏膜过度增生，Runx3蛋白对胃黏膜上皮细胞的生长和分化均具有重要调控作用。Ito等〔5〕应用免疫组化方法检测了97例胃癌标本和21株胃癌细胞株，表明Runx3蛋白表达与胃癌密切相关。本研究提示Runx3蛋白表达下调可能与胃癌的发生有关。Hsu等〔6〕研究也表明，39%(37/95)的胃癌Runx3蛋白表达缺失，Runx3蛋白表达和胃癌组织分化、淋巴结转移密切相关。Runx3蛋白参与TGF-β信号传导通路，与细胞分化、周期调控、凋亡和恶性转化有关〔1〕，Runx3蛋白表达缺失，引起TGF-β信号传导通路调节紊乱，参与胃癌的发生发展。

iNOS主要由肿瘤细胞和巨噬细胞在机体病理过程中产生，在正常组织不表达，一旦表达则持续催化产生大量NO。研究发现NO的生物学作用广泛，主要通过激活癌基因/抑制抑癌基因、抗凋亡/促增殖、促肿瘤血管生成、促肿瘤侵袭与转移、抑制宿主免疫等各种途径参与肿瘤的发生、发展、转移等过程〔7〕。目前已在多种肿瘤组织中检测到iNOS的表达明显高于正常组织，并与肿瘤的发生和发展相关。Feng等〔8〕报道，胃癌组织中iNOS蛋白表达与淋巴结转移有关，iNOS蛋白表达的增加参与了胃癌的发生与浸润。本研究提示iNOS蛋白表达升高可能与胃癌的发生有关。Wang等〔9〕研究表明iNOS蛋白表达与胃癌形成密切相关，结果提示iNOS可能参与了胃黏膜癌变形成的整个过程，是胃癌发生发展转移中的危险因素之一。

HP感染可能促进胃癌的侵袭和转移〔10〕。本研究显示持续HP感染可使胃黏膜病变逐渐加重，从而使胃癌发病的危险性增高，胃癌中HP感染升高iNOS蛋白表达，但却降低Runx3蛋白表达，HP感染影响胃癌Runx3、iNOS蛋白表达。HP产生的细胞毒素能刺激炎症细胞活化iNOS，有报道HP感染患者胃黏膜iNOS表达增加，而根除HP或加用抗氧化作用药物以后iNOS明显下降，导致iNOS激活的机制可能是HP感染后，炎症细胞产生的炎症介质是iNOS的激动剂〔11〕。而且胃癌中Runx3蛋白和iNOS蛋白表达之间存在显著负相关(r=－0.349，P＜0.01)。Katayama等〔4〕最近通过胃上皮细胞和巨噬细胞共同培养的方法进行研究发现，HP诱导巨噬细胞产生NO，NO引起胃上皮细胞Runx3甲基化发生，这种甲基化作用能够被特异性的iNOS抑制剂所逆转，HP通过NO介导诱导Runx3甲基化发生，NO在此过程中发挥中枢角色，Runx3甲基化发生导致蛋白低表达或缺失。结果初步表明iNOS蛋白在HP感染影响Runx3蛋白表达中发挥重要的作用，胃癌发生中幽门螺杆菌感染是通过NO介导对Runx3基因表达进行调节。

本研究显示胃癌组织中Runx3蛋白表达与患者生存率显著相关，iNOS蛋白表达与胃癌患者生存率无关。已有研究显示Runx3蛋白与胃癌患者的不良预后密切相关〔6，12〕。Araki等〔13〕在对98例肺腺癌患者5年生存率的研究中也得出相同的结论。本研究显示iNOS蛋白表达可能发生于胃黏膜癌变形成的整个过程，在胃癌发展病程中起促癌作用。而正是因为在HP感染诱发iNOS蛋白表达的促癌作用下，通过甲基化作用而导致Runx3蛋白低表达或缺失，Runx3蛋白表达在胃癌发生发展、浸润转移及预后病程中起关键性作用。因此如本研究所示，胃癌患者预后不良与Runx3蛋白表达有关，而与iNOS蛋白表达无关，通过检测胃癌组织中Runx3蛋白的表达可作为预测胃癌患者预后一个良好的分子标志物，并可指导临床选择合理的治疗方案。

HP感染可以作为胃癌的启动因子，HP感染是通过NO介导对Runx3基因表达进行调节而参与胃癌的发生、发展，从基因水平阐明了胃癌发病新的分子机制。iNOS蛋白在胃癌发生发展中起促癌作用，与起关键性作用的Runx3蛋白起协同作用。治疗HP感染、干预iNOS蛋白表达可达到对胃癌预防的效果，通过诱导Runx3蛋白重新表达，可以为胃癌基因治疗提供新的靶点。

1 Li QL，Ito K，Sakakura C，et al.Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer〔J〕.Cell，2002;109(1):113-24.

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