溃疡性结肠炎患者病灶组织血管内皮生长因子、细胞外调节蛋白激酶－1、－2表达与病程的相关性

刘宝海 朴雪花(辽宁医学院附属第一医院消化科，辽宁 锦州 200)

溃疡性结肠炎主要因结肠黏膜表皮溃疡，导致肠道无法发挥正常消化吸收功能，进而造成排便困难和便血等症状，临床主要以腹泻、排便出血等症状为主〔1〕。老年人患溃疡性结肠炎后，身体虚弱，抵抗能力急剧下降，各方面体征较年轻人严重〔2〕。本文主要探讨血管内皮生长因子(VEGF)、细胞外调节蛋白激酶-1(ERK-1)和ERK-2与不同程度的溃疡性结肠炎的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 128例溃疡性结肠炎患者为2011年1月至2012年1月来中国医科大学附属盛京医院与北京中医药大学附属东直门医院接受诊断和治疗，按照诊断结果可分为四组。30例初发型溃疡性结肠炎患者为初发型组，男16例，女14例，年龄51～66〔平均(56.7±2.4)〕岁;31例慢性复发型溃疡性结肠炎患者为慢性复发性组，男17例，女14例，年龄51～66〔平均(57.1±3.3)〕岁;32例慢性持续型溃疡性结肠炎患者为慢性持续型组，男17例，女15例，年龄51～66〔平均(57.9±4.2)〕岁;34例急性暴发型溃疡性结肠炎患者为急性暴发性组，男17例，女17例，年龄51～66〔平均(56.2±2.6)〕岁。四组患者性别比、平均年龄无显著性差异，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 纳入标准 (1)通过造影检测诊断为溃疡性结肠炎，可在结肠处观察到明显溃疡病灶;(2)年龄≥50岁;(3)具有反复发作的腹泻、腹痛、黏液便、脓液便等典型的临床表现，至少有结肠镜“X”线特征性改变中的一项;(4)细菌性痢疾、阿米巴性结肠炎等病因明确的结肠炎排除在外;(5)非溃疡性结肠炎腹泻、腹痛、便秘等常见的临床症状排除在外;(6)结肠溃疡外的胃溃疡等消化道疾病排除在外。

1.2.2 内镜检查 集中对患者直肠和乙状结肠处进行内镜扫描，观察黏膜表面是否有溃疡、溃疡类型以及面积等。各种类型溃疡性结肠炎检查标准:(1)初发型:内镜检查诊断为溃疡性结肠炎，且为首次未有过往史;(2)慢性复发型:内镜检查诊断为溃疡性结肠炎，既往结肠炎患病史，又复发，且病变范围较之前小;(3)慢性持续型:内镜检查为溃疡性结肠炎，且属首次，病程有半年以上，伴持续性腹泻、腹痛等症状;(4)急性暴发性:内镜检查为溃疡性结肠炎，发病快，症状严重且伴有高热、急性结肠扩张等症状。

1.2.3 病灶组织VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平检测所有患者在进行内镜检查时，镜头均触及溃疡病灶处，取出镜头后收集镜头上的组织残留物，使用TAKARA的mRNA抽提试剂盒进行总mRNA抽提。使用TAKARA逆转录试剂盒扩增出cDNA，然后使用各自引物扩增VEGF、ERK-1、2片段，同时扩增出内参分子β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA。使用2%琼脂糖电泳扩增片段，并且使用Bio-rad凝胶成像仪和Image Lab软件进行拍照和光密度分析。

1.2.4 病灶组织 VEGF，ERK-1和ERK-2免疫组化检测 取出患者病灶组织后，用4%多聚甲醛固定8 h后，用20%蔗糖脱水3 d(4℃)，用冷冻切片机切成冠状切片，收集于磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后分装进96孔板中，每个患者组织做三个复孔。按照参考文献〔3〕进行操作，一抗为大鼠抗VEGF、ERK-1、2多抗，采用浓缩型链霉素和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产)进行实验，二抗为试剂盒自带的兔抗大鼠Fc段抗体，采用试剂盒显色方法进行显色，并拍照。

1.3 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件进行分析，数据资料以表示，所有计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 病灶组织细胞内VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平以β-actin光密度为内参，四组患者病灶组织VEGF和ERK-1、2 mRNA相对光密度值逐渐增加，说明老年溃疡性结肠炎逐渐增加，病灶组织细胞内VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA转录水平逐渐增加。见图1。

2.2 病灶组织VEGF，ERK-1和ERK-2免疫组化结果 VEGF阳性率、ERK-1、2阳性率均随着溃疡性结肠炎进展而不断增加。四组患者VEGF和ERK-1、2平均阳性率逐渐增多，在急性暴发性患者中VEGF阳性率高达39.59%，ERK-1阳性率高达31.47%，ERK-2阳性率高达24.12%，比较各组间阳性率有显著性差异(均P＜0.05)。见图2，图3。

图1 病灶组织内VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平

图2 病灶组织VEGF，ERK-1和ERK-2免疫组化结果

图3 四组患者病灶组织VEGF，ERK-1和ERK-2阳性率比较

3 讨论

认为病灶组织VEGF、ERK-1和ERK-2是溃疡性结肠炎发生的危险因素，其表达水平随着病情的进展而增加，具有预测溃疡性结肠炎严重程度的潜在价值。

溃疡性结肠炎属于炎症性肠病，主要是由于肠道发生炎症损伤导致〔4〕，目前发病机制仍不确切，主要为基因因素、机体免疫力和环境因素三种原因单独或者多方面原因综合导致〔5〕。其中机体免疫抵抗力是老年人易发溃疡性结肠炎的主要病因。有研究发现老年患者肠道黏膜免疫系统抵抗细菌的侵袭能力较年轻人弱，同时M细胞的数量也大大降低，该因素与溃疡性结肠炎发生率具有正相关性〔6〕。

溃疡性结肠炎的诊断包括内镜、钡灌肠和相关因子检查，内镜和灌肠检查可直接观察出病灶处溃烂状态，并且能够区分出不同类型溃疡性结肠炎，在临床上被证明阳性检出率高达90%以上〔7〕。但随着人们对生活质量的不断追求，内镜检查和钡灌肠检查逐步被取代，从而限制了该方法在老年患者身上大量应用。内镜检查易发人体呕吐，痉挛等〔8〕，钡灌肠检查残余的钡盐会对机体特别是对老年人带来危害〔9〕。

相关因子例如细胞因子、各类代谢因子等均被证明与老年溃疡性结肠炎具有相关性。有研究表明，病灶位置处细胞膜上趋化因子受体表达量较正常组织显著提高〔10〕，说明患病后大量的趋化因子会富集在病灶位置发挥着炎症作用。VEGF和ERK-1/2均被证明与溃疡性结肠炎相关，其中VEGF被认为是肿瘤新生血管非特异性标记物，新生血管需要VEGF和受体的作用而发挥血管再生功能，但这VEGF的过表达在结肠炎溃疡组织处也被发现，表明该因子与炎症相关〔11〕，本文发现在病灶位置处确实存在VEGF随着病情加重逐渐增多的现象，mRNA转录的增加说明VEGF非其他组织通过血液转移过来，而是组织本身细胞表达增加的缘故。ERK-1/2是有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶信号通路中关键的信号蛋白，通过磷酸化发挥着信号通路开启和关闭功能，从而引导转录因子的开启和关闭，控制着细胞因子等的表达。有研究表明ERK-1/2在溃疡性结肠炎中确实存在磷酸化，起到连接转移生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子(TNF)细胞内发挥功能的作用。本文的研究结果与VEGF类似，证明了ERK-1/2非旁分泌作用转移到病灶位置，而是通过自分泌方式在病灶位置大量表达，从而发挥其生物学功能。

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11 〔No authors listed〕VEGF contributes to ulcerative colitis pathogenesis〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2009;328(3):681.