Bcl-2蛋白对自噬和凋亡的调控及其相关机制

董 琳 童 煜 毛 萌

凋亡和自噬是真核生物中重要的生理和病理现象，在哺乳动物发育，维持细胞稳态中起重要作用，并与疾病的发生、发展密切相关。两者在形态学、信号通路及生化代谢途径方面有着显著区别。凋亡的典型特征是胞质皱缩，核固缩，DNA降解，凋亡小体形成，而残余的细胞会被吞噬细胞识别、吞噬并降解;自噬以包裹胞质内容物的双层膜结构的自噬小体出现为标志，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬在决定细胞命运时具有两面性:一方面，过度激活自噬会导致细胞死亡;另一方面，自噬也可作为细胞的自救行为，在某些病理状态下(如饥饿、生长因子剥夺、缺氧缺血等)通过降解胞质内容物维持自身存活。目前认为，凋亡和自噬有着潜在联系。Bcl－2蛋白是一个与凋亡和自噬均密切相关的蛋白。近年来，随着对Bcl－2蛋白构象与功能的进一步研究，发现其在凋亡和自噬过程中具有双重调控的功能，并介导两者之间的交织和串流。本文重点综述Bcl－2蛋白在凋亡和自噬调控中的相关机制及其内在联系。

一、Bcl-2蛋白及其亚细胞定位

Bcl－2蛋白是Bcl－2原癌基因的编码产物，是细胞存活促进因子，属膜整合蛋白，分子质量为26kDa，定位于线粒体、内质网和连续的核周膜，是Bcl－2家族中的抗凋亡蛋白成员，其多肽链中含有4个保守的α螺旋结构域(BH1－BH4)。Bcl－2蛋白定位于细胞的不同部位，其分子构象在不用的因素作用下可发生改变导致亚细胞定位发生变化，或在细胞的不同部位与其他蛋白相互作用，从而在凋亡和自噬中起调控作用。

线粒体是Bcl－2家族成员发挥调控凋亡作用的重要细胞器。Bcl－2家族是凋亡通路的关键分子，通过抗凋亡和促凋亡蛋白之间的相互作用，影响线粒体结构和功能的稳定性［1］。在凋亡相关信号刺激后，促凋亡蛋白发生一系列改变(如Bax构象变化，Bid和Bim裂解效应，Bad、Bik的磷酸化调节等)，并向线粒体外膜靶向异位，导致线粒体通透转换孔的开放，释放促凋亡因子，激活caspase级联，执行细胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl－2对凋亡的拮抗作用也发生在线粒体膜上，膜蛋白分子表面的疏水凹槽可以容纳促凋亡Bcl－2家族成员的BH3结构域，使其不能有效的发挥促凋亡活性。

近来研究显示，抗凋亡蛋白Bcl－2对自噬的调节具有细胞器特异性。只有定位于内质网，而非线粒体的抗凋亡蛋白Bcl－2能与beclin1形成复合体，对自噬起负调节作用［2］。可见，Bcl－2蛋白参与凋亡和自噬的调节，其构象改变和亚细胞定位的变化对其生物功能的发挥起着重要作用。

二、Bcl-2蛋白在细胞自噬中的调控作用

Beclin 1(在哺乳动物细胞中与酵母自噬基因Atg6同源)是与Bcl－2相互作用参与自噬调控的重要因子。beclin 1参与形成Ⅲ型PI3K复合物，引导自噬相关蛋白向自噬体膜靶向定位，从而促使自噬体双层膜形成。基因敲除小鼠胚胎干细胞后发现，beclin 1－/－小鼠在胚胎早期全部死亡，杂合子(beclin 1+/－)的小鼠可以存活，但体内Beclin 1蛋白表达显著降低，导致其自噬功能的削弱及自发肿瘤的发生显著升高。由此beclin 1作为新型的仅包含BH3的Bcl－2蛋白家族成员，也是一个单倍不足的抑癌基因，在胚胎发育、肿瘤形成及自噬诱导中起着关键作用［3］。

抗凋亡蛋白Bcl－2具有可容纳BH3结构域的疏水凹槽，当其与beclin1结合后形成Bcl－2－beclin 1－Vps34复合物，导致脂质激酶Vps34活性明显降低，抑制beclin 1介导自噬的功能［4］。Bcl－2和beclin 1的相互作用可以通过两个不同机制进行调节(图1):(1)含有BH3结构域的蛋白或BH3模拟物可同beclin 1竞争结合Bcl－2蛋白的BH3连接凹槽，从而解除Bcl－2对beclin1的抑制而诱导自噬。BH3模拟物ABT737能竞争性占据Bcl－2的BH3疏水连接凹槽，抵消Bcl－2对beclin 1的抑制作用。该过程与常态低水平自噬向高水平转化密切相关，并拮抗了ABT737的抗凋亡活性。下调人类HeLa细胞或小鼠胚胎纤维母细胞的bad基因表达，饥饿诱导该类细胞发生自噬的程度明显降低，予以ABT737后可得到恢复。(2)在营养缺乏和氧化应激等刺激下，原癌基因c－Jun氨基末端激酶1(JNK1)可通过使Bcl－2的非结构环内T69、S70、S87 3个位点磷酸化来破坏其与beclin 1的结合能力，促进自噬的发生［5］。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)敲除jnk1基因后，饥饿刺激不能使Bcl－2蛋白以上位点磷酸化、下调Bcl－2和beclin 1的亲和力;Bcl－2蛋白的磷酸化突变体(T69E/S70E/S87E)亦不能与beclin 1蛋白相互作用，丧失对细胞自噬的抑制功能。

图1 Bcl-2与beclin1相互作用参与细胞自噬的调节机制

上述两个不同调节机制之间可能存在功能性的联系:磷酸化Bcl－2蛋白减少了其对Bax以及其他BH3－only蛋白如Bid的亲和力，而非磷酸化的Bcl－2突变体(T69A/S70A/S87A)增强了其对3个不同的BH3－only蛋白(Bid、Bad和Bim)的亲和力，显示多位点磷酸化的Bcl－2蛋白可能降低与包括beclin 1蛋白在内的多种BH3结构域蛋白的亲和力。另一个猜测是Bcl－2蛋白磷酸化作用可能改变蛋白构象，对含有BH3结构域蛋白的选择发生特异性改变，干扰了其与beclin 1的相互作用。另外，Bcl－2通过与beclin1相互作用调控自噬主要发生在内质网。当存在于内质网膜上的三磷酸肌醇受体(IP3R)被阻断后可强烈诱导自噬。最近发现的营养剥夺性自噬因子 －1(nutrient－deprivation autophagy factor－1，NAF－1)可将Bcl－2与IP3R连接，从而将其靶定于内质网，推测IP3R复合体可能是Bcl－2与beclin 1在内质网上相互作用的桥梁［6，7］。

三、Bcl-2蛋白与细胞凋亡

Bcl－2家族是参与凋亡调控的关键分子，抗凋亡和促凋亡蛋白相互作用，共同调节线粒体结构和功能的稳定性。Bcl－2抗凋亡蛋白通过BH3结构域与同族的促凋亡蛋白形成异源二聚体，维持蛋白在细胞内的稳定分布。在凋亡相关信号刺激后，促凋亡蛋白受到一系列调节，如Bax构象变化，Bid和Bim裂解效应，Bad、Bik的磷酸化调节等，促凋亡成员向线粒体外膜靶向异位，导致线粒体通透转换孔的开放，释放促凋亡因子，激活caspase，执行细胞凋亡。

最近研究发现，免疫细胞中的Bcl－2蛋白抗凋亡功能与热休克蛋白家族成员Hsp90β有密切联系，这可能依赖于热休克蛋白的“分子伴侣”功能，对凋亡进行调控。用人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)处理小鼠巨噬细胞株RAW264．7，可抑制热休克蛋白Hsp90β对Bcl－2抗凋亡蛋白的影响，导致后者丧失抗凋亡活性，启动线粒体凋亡途径介导细胞死亡［8］。在大鼠嗜碱性白血病细胞株(RBL－2H3)和小鼠骨髓生成的肥大细胞的凋亡诱导研究中也发现了Hsp90β与Bcl－2蛋白抗凋亡效力的相关性。此外，抗凋亡蛋白在某些特定环境下对凋亡具有正性调控作用［9］。研究表明 Bcl－2蛋白环区的天冬氨酸(Asp34)是caspase－3的酶解位点，Bcl－2对凋亡的抑制受到caspase－3的调节，后者能够在Asp34的位置切割Bcl－2蛋白，被裂解的Bcl－2向线粒体外膜转移，通过BH3和跨膜结构域上调细胞凋亡。在HEK293T细胞株和人类外周血淋巴细胞中发现，孤儿核受体Nur77/TR3出核定位于线粒体，绑定Bcl－2蛋白并使其构象发生变化，触发线粒体死亡途径，诱导凋亡［10］。最近一项研究发现，2－甲氧基－抗霉素A处理大鼠胰岛素瘤细胞系β细胞(INS－1细胞)或鼠科TGF－α(转化生长因子－α)转染肝细胞株后，Bcl－2/Bcl－xl过表达的细胞具有较高的细胞毒性，其过表达可能提示预后较好［11］。

四、Bcl-2蛋白在凋亡和自噬中的串流

1．Bcl－2蛋白对Ca2+信号的调节:Ca2+作为重要的第二信使，在细胞凋亡和自噬调控中都起到了十分重要的作用。钙离子信号与Bcl－2家族蛋白相互作用调节亚细胞结构(包括细胞质、内质网和线粒体)中的钙库。Bcl－2家族对作用于线粒体Ca2+的调节表现在对线粒体通透性转变孔(MPTP)的开放影响上。研究表明当MPTP开放时导致线粒体膜电位下降，Ca2+内流，这是启动线粒体途径细胞凋亡的直接原因。非磷酸化的Bad将线粒体表面存在的Bax同源二聚体单聚化，形成细胞色素C和Ca2+内流的交换通道。其中，Bcl－2蛋白和1，4，5三磷酸肌醇受体(IP3R)相互作用，直接抑制Ca2+从内质网释放;Bcl－2蛋白亦可以降低内质网腔内钙网蛋白(calreticulin)和钙泵的表达来下调内质网内的Ca2+浓度［12］。Bcl－2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白彼此结合、彼此抑制，协同决定凋亡的发生。

早期研究发现，用维生素D3及其类似物EB1089处理乳腺癌细胞株MCF－7影响细胞内游离Ca2+浓度，上调的Ca2+水平可激活自噬且这一过程与beclin 1基因的表达上调有关;进一步研究证实，Ca2+水平的增加，通过相继活化钙调蛋白依赖性激酶 β(CAMKK－β)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，抑制Akt－mTOR 通路，引发自噬［13］。然而，ER 定位的Bcl－2蛋白则可以改变ER膜系统渗透性或Bcl－2/xl形成类似白喉毒素和大肠杆菌的成孔结构域，形成离子传导通道，使ER内的Ca2+直接释放到胞质中，有效地遏制该信号通路［14］。由此可见，Ca2+是Bcl－2蛋白连接凋亡与自噬的一个重要信号分子。

2．Atg 5参与自噬和凋亡的转换:参与自噬发生的蛋白主要由自噬相关基因(autophagy－related gene，atg)编码，其中Atg5参与Atg12泛素样蛋白加工修饰过程，形成Atg12－Atg5复合体，对于自噬体膜的形成和延展必不可少，并与Atg8/LC3的加工修饰过程相互影响。Atg5是自噬发生的重要调控位点之一，其表达可被TOR信号通路调控，从而影响自噬。此外，Atg5表达增高可令多种细胞，如乳腺肿瘤细胞，在各种刺激下更易具凋亡倾向。Atg5经过翻译后修饰在凋亡中也起着关键作用［15］。

下调粒细胞集落刺激因子(GM－CSF)诱发人类中性粒细胞(PMN)凋亡，或以抗CD95的特异性单克隆抗体诱导T细胞Jurkat细胞株发生凋亡的过程中均可发现 Atg5裂解物。24kDa的 truncated－Atg5(tAtg5)失去激活自噬的功能，靶向线粒体易位，释放细胞色素C、活化caspase，具有促凋亡活性。实验分析表明，tAtg5是由半胱氨酸蛋白酶家族成员calpain 1和calpain 2在Atg5的191－196位点直接裂解而成的(1～193)氨基酸产物。高水平表达的Bcl－2蛋白可保护细胞免受tAtg5表达增加而引起凋亡性细胞死亡。Atg5的191～196位点由半胱氨酸蛋白酶家族成员calpain 1和calpain 2直接裂解成24kDa的truncated－Atg5(tAtg5)失去参与自噬的功能，并向线粒体易位与Bcl－xL连接，置换Bcl－xL－Bax复合物，抑制Bcl－xL抗凋亡活性，活化Bax形成Bax－Bax同源二聚体，促进凋亡［16］。高水平表达的Bcl－2可保护细胞免受tAtg5增加而引起的凋亡。Atg5通过不同的结构形式参与了自噬和凋亡之间的转换，并可与多种Bcl－2家族成员相互作用，其具体机制尚待进一步研究。

3．BH3结构域及其模拟化合物:BH3－only蛋白一方面通过其BH3结构域与Bcl－2结合，诱导自噬;另一方面直接或间接激活Bax/Bak样促凋亡蛋白的活性，协同调节细胞凋亡。定位于内质网的beclin 1通过其BH3结构域与Bcl－2/Bcl－xL结合，使细胞内游离Beclin 1的浓度降低，进而下调Ⅲ型PI3K复合体活性，减弱自噬。Bad过表达可增加细胞内自噬相关微管相关轻链蛋白3(LC3)的点状聚集，当Bad的BH3结构域被破坏，其诱导自噬的活性显著降低。ABT－737是模拟BH3结构域的非肽类有机低分子，与抗凋亡蛋白Bcl－2，Bcl－xL和Bcl－w亲和力较高。ABT－737能与beclin1竞争性结合Bcl－2/Bcl－xL，从而使 Bcl－2/Bcl－xL与 beclin1分离，引发自噬［17］。有趣的是，BH3－only蛋白成员(Bad，Noxa，t－Bid等)往往被认为具有促凋亡特性，但beclin 1蛋白是一个例外。研究显示来源于beclin 1的含有BH3结构域的肽段具有凋亡诱导特性，然而，全长beclin 1过表达却未能引起明显的细胞凋亡。此外，与beclin 1相互作用的Bcl－2/Bcl－x，可能亦没有丧失其抗凋亡特性［18］。自噬是不同环境中对刺激的适应性反应从而促使细胞存活或是潜在的凋亡诱因，还是导致细胞死亡的直接原因仍是近年来研究的重点。BH3－only蛋白被推测可通过线粒体在自噬和凋亡的转换间起到的“开关”的角色:低强度的刺激信号下引起线粒体膜通透性(MMP)的改变后，BH3－only蛋白竞争性结合Bcl－2，增加游离beclin 1水平，激活自噬从而降解受损的线粒体;当刺激信号的强度达到一定水平时，BH3－only蛋白启动线粒体途径的细胞凋亡，同样通过BH3结构域结合Bcl－2，拮抗后者抗凋亡作用，解除对Bax和Bad的抑制，介导MMP增加，释放细胞色素C，驱使caspase活化行使凋亡功能［19］。

4．Bcl－2蛋白磷酸化功能:某些病理状态下，如饥饿、生长因子剥夺、缺氧缺血损伤时，c－Jun氨基末端激酶1(JNK1)可介导Bcl－2蛋白BH3和BH4之间的非结构环多个位点磷酸化，这一过程可能参与细胞凋亡和自噬的调节。HeLa细胞在饥饿刺激下，Bcl－2磷酸化快速发生(约4h)，通过Bcl－2－Beclin 1复合体解离后诱导自噬，启动可修复的细胞器损伤;随着时间延长(16h)，自噬对细胞的自救行为不能再保证细胞存活，Bcl－2磷酸化转而干扰Bcl－2－Bax复合体，激活caspase 3依赖性凋亡通路［5］。此外，最近的研究显示，死亡相关蛋白激酶(DAP－kinase)也可介导beclin 1的BH3结构域某些位点磷酸化，通过削弱beclin 1和Bcl－2的结合能力上调自噬水平。Bcl－2蛋白磷酸化可能参与了凋亡和自噬的调控以及两者机制之间的转换［20］。

五、结 语

综上所述，自噬和凋亡之间可能存在相互依赖和交叉作用，二者共同调控细胞的生存和死亡。Bcl－2是涉及自噬和凋亡相互影响、相互转化中的重要蛋白;它可通过线粒体凋亡通路和beclin 1依赖性细胞自噬信号通路以及与不同通路中Bcl－2家族其他蛋白成员之间的相互作用和构象变化等方式对自噬和凋亡进行双重调控。Bcl－2蛋白在自噬和凋亡中的串流作用可能与两者间的相互影响，相互转化密切相关，不同内、外环境影响以及不同组织和细胞中的相关信号通路的各种效应所产生的协同或拮抗作用有待进一步解释和探讨。随着研究的不断深入，Bcl－2蛋白及其家族成员在自噬或凋亡过程中如何发挥直接或间接的作用的具体作用机制，及其是否作为两者潜在的交汇点等问题将取得突破性进展。Bcl－2蛋白与程序性细胞死亡机制的相关性可为疾病的发病机制和治疗应用等相关研究领域提供新的思路。

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